میکروب شناسی آب

میکروب شناسی آب:

آبی که به صورت باران,تگرگ و برف بر سطح زمین می ریزد دارای میکروب های موجود در هواست .هنگام نزول باران مقدار قابل ملاحظه ای از میکروارگانیسم های هوا کاسته می شود.آب باران پس از شستن سطح خاک به طرف دریاچه ها و اقیانوس عا سرازیر می شود و میکروبهای هوا و خاک را با خود به طرف منابع طبیعی آب میبرد.آبی که از طبقات مختلف زمین عبور می کند و به قسمت های عمیق خاک میرود در مراحل مختلف اکثر میکروبهای خود را از دست می دهد. در حقیقت طبقات مختلف زمین مانند صافی عمل کرده جمعیت میکروبهای اینگونه آبها را کم می کنند.به طور کلی چون منشا آبهای مختلف با یکدیگر تفاوت دارند لذا نوع میکروارگانیسم های موجود در آنها نیز با هم متفاوت اند.

مباحث مختلف میکروب شناسی آب شامل میکروب شناسی اقیانوس ها ,دریاها,تالابها,حوضچه ها,نهرها,رودخانه ها,آب آشامیدنی و فاضلابهاست.

چون آب قادر به حمل میکروارگانیسم های مختلف است لذا می تواند یکی از عوامل مهم و اساسی مؤثر در بهداشت یک منطقه باشد.عوامل بیماریزا که توسط آب منتقل می شوند بیشتر در دستگاه گوارش بیماری تولید می کنند.عوامل بیماریزا در مدفوع افراد آلوده وجود دارند و چنانچه این عوامل در شرایطی از طریق فاضلاب ها با آب آشامیدنی تماس حاصل کنندباعث بروز بیماری در افراد سالم می گردد.آبی که فاقد میکروارگانیسم های بیماری زا و مواد شیمیایی زیان آور باشد “آب آشامیدنی” و آبی که به وسیله فاضلاب آلوده شده باشد “آب آلوده ” خوانده می شود.

تشخیص آلودگی آب از نظر باکتری شناسی:

آبی که کاملا شفاف و بدون بو و طعم است ممکن است آلوده به میکروارگانیسم باشد.آزمایشهای باکتری شناسی برای تشخیص میزان آلودگی آب فقط مربوط به تشخیص عوامل بیماری زای موجود در آب نیستزیرا عوامل بیماری زا به  تعداد خیلی کم وارد آب می شوند و اکثراً پس از ورود به آب برای مدت طولانی قادر به ادامه زندگی نیستند .در نتیجه برای تشخیص آلودگی آب وجود گروهی از باکتری هاکه در حالت طبیعی در روده ی انسان و جانوران زندگی می کنند و به نام کلی فرم ها موسوم اند و همچنین استرپتوکوکوس فکالیس,کلاستریدیوم ولشی ای ,کلاستریدیوم پرفرژنس در آب جستجو می شوند.

تشخیص انواع ذکر شده در آب دلیل بر آلودگی آن توسط مدفوع است و از طرفی چون عوامل بیماری زا از طریق مدفوع افراد آلوده وارد آب می شوند,وجود و تشخیص انواعی از باکتری ها مانند کلی فرم ها در آب دلیل بر آلودگی آب توسط مدفوع است.انتخاب کلی فرم ها به ویژه گونه اشریشیاکلی به عنوان شاخص آلودگی به این علت است که این باکتری در روده ی آدمی به تعداد زیادی وجود دارد و در مقایسه با انواع باکتری های بیماری زا مدت طولانی تری در آب زنده می ماند.کلی فرم ها گروهی از باسیل های گرم منفی بدون هاگ هوازی یا بی هوازی اختیاری و تولید کننده ی گاز در محیط واجد لاکتوز هستند.نمونه های اصلی این گروه از باسیل ه عبارتند از اشریشیا کلی و انتروباکتر آئروژنز.

برای تشخیص آلودگی آب وهنگام نمونه برداری رعایت نکات زیر ضروری است:

۱-      نمونه ها باید تحت شرایط سترون و در بطری های سترون گرفته شوند

۲-      نمونه ها باید معرف مخزنی باشند آب از آن مصرف شده است

۳-      هنگام نمونه برداری باید دقت شود آلودگی اضافی رخ ندهد

۴-      جهت از بین بردن (خنثی کردن ) کل موجود در آب باید در داخل بطری نونه گیری قبل از استریلآن مقداری کریستال تیوسولفات سدیم ریخت

۵-      نمونه ها باید هرچه زودتر پس از جمع آوری مورد آزمایش قرار گیرند و چنانچه آزمایش آب با تأخیر همراه باشدنمونه ها باید در دمای بین صفر تا ۱۰ درجه سانتی گراد نگه داری شوند.

آزمایش های باکتری شناختی که جهت تشخیص آلودگی آب انجام می شود عبارتند از:

۱-      آزمایش برای تشخیص کلی فرم ها در آب

۲-      شمارش تعداد باکتری های موجود در آن

شمارش تعداد باکتری ها در آب:

روش کار:

۱-      برای شمارش تعداد باکتری ها در آب دو نمونه آب لوله کشی و آب نهر را انتخاب کرده

۲-      در مورد آب نهر آن را تا رقت ⁵ ̄ ۱۰ رقیق کنید و آب لوله کشی را بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار دهید

۳-      از آب های مورد استفاده روی پلیت ها کشت می دهیم و پلت ها را ۴۸ ساعت در گرمخانه ی ۳۵ درجه سانتی گراد بگذارید سپس به بررسی و شمارش تعداد کلنی ها یا تعداد باکتری های موجود در ۱ سی سی از آب بپردازید.

از روی تعداد کلی باسیل های موجود در آب آبها را به سه دسته زیر تقسیم می کنند:

الف – آب بسیار خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن کمتر از یک اشریشیا کلی وجود دارد

ب – آب خوب که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن یک تا دو اشریشیاکلی وجود دارد

ج – آب مشکوک که در هر ۱۰۰ سانتی متر مکعب آن بیش از ۱۰ اشریشیاکلی وجود دارد

تشخیص کلی فرم ها در آب:

برای شناسایی و شمارش کلی فرم ها محیط های انتخابی و افتراقی و روش خاصی لازم است.به این منظور دو روش اساسی شناخته شده است: الف – روش MPN (Most probable Number ) ب – روش فیلتر غشایی

الف – روش MPN :در این روش کلی فرم ها را در چند مرحله شناسائی می کنند: ۱- مرحله احتمالی ۲- مرحله تأییدی ۳- مرحله تکمیلی. در مرحله احتمالی رقت هایی از نمونه آب را به لوله های محتوی آبگوشت لاکتوز دار و معرف PH (لاکتوز فنل رد براث ) اضافه کرده و آنها را تا ۲۴ الی ۴۸ ساعت در گرمخانه قرار می دهند.تخمیر لاکتوز به اسید و گاز نشانه مثبت بودن واکنش است. در آزمایش احتمالی متداول در ۱۵ لوله حاوی محیط کشت نمونه آب را کشت میدهند (در هر یک از ۵ لوله اول ۱۰ میلی لیتر ,در ۵ لوله دوم یک میلی لیتر و در ۵ لوله سوم ۱/۰ میلی لیتر) .اگر اسید و گاز در هیچ یک از لوله ها پیدا نشود آب از نظر بهداشتی رضایت بخش در نظر گرفتته می شود و از نظر آماری این حالت نشانگر کمتر از ۲/۲ کلی فرم در هر ۱۰۰ میلی لیتر آب است .

هرگاه یک سری از لوله ها در آزمایش احتمالی نتیجه مثبت نشان دهند,تست اضافی انجام می گیرد زیرا میکروب های دیگری غیر از کلی فرم ها می توانند لاکتوز را با تولید گاز تخمیر نمایند. در آزمایش تأییدی از لوله های مثبت برداشت کرده و بر روی محیط افتراقی (ائوزین متیلن بلو آگار ) به طور خطی کشت می دهند.با توجه به اینکه کلی فرم ها از لاکتوز اسید تولید می کنند لذا کلنی هایی با مرکز تیره رنگ ایجاد می کنند .در عین حال اشریشیاکلی کلنی های بزرگ با مرکز تیره رنگ با درخشندگی ویژه,متمایل به سبز ایجاد می کند که علت ایجاد این درخشندگی یا جلای فلزی سبز ,آزاد شدن آزاد شدن ائوزین از محیط E.M.B و اکسید شدن آن در مجاورت هواست .ائوزین در محیط به صورت ترکیب با سولفیت سدیم است.در اثر رشد اشریشیاکلی از تخمیر لاکتوز ماده حدوسطی از جنس استالدئید تشکیل می شود که این ماده با سولفیت سدیم ترکیب شده سبب آزاد شدن معرف ائوزین می گردد.

پیدایش این نوع کلنی ها نشانگر مثبت بودن آزمایش تأییدی است.در آزمایش تکمیلی تک تک کلنی ها را از محیط تأییدی برداشت کرده و در آبگوشت لاکتوز دار و همچنین در محیط TSI ,24 ساعت در ۳۵ درجه قرار می دهند.هرگاه در این محیط ها اسید و گاز ایجاد شود و کلنی جدا شده گرم منفی , میله ای شکل و بدون اسپور باشد نتیجه آزمایش تکمیلی را مثبت اعلام می کنند.

ب)کلی فرم ها را همچنین می توان با روش فیلترهای غشائی نیز شناسایی کرد. بدین ترتیب ۱۰۰ میلی لیتر از آب مورد آزمایش را از فیلتر غشائی که قطر منافذ آن ۴۵/۰ میکرون است عبور می دهند.باکتری ها بر سطح فیلتر باقی می مانند,آنگاه پالایه را بر روی محیط کشت قرار می دهند.باکتری های کلی فرم بر روی فیلتر آغشته به ماده غذایی کلنی هایی مشخص رشد می کنند.هرگاه فقط یک کلنی از این ۱۰۰ میلی لیتر آب رشد کند آب را معمولاٌ از نظر آشامیدن سالم و بهداشتی می شناسند.

انواع رنگ آمیزی میکروب ها(رنگ آمیزی ساده,افتراقی,مخصوص)

انواع رنگ آمیزی میکروب ها:

یکی از مشخصات مهم باکتری ها که به شناسایی آنها کمک می کند رنگ پذیری آنها با رنگ های مختلفی است که برای این منظور به کار می روند.این رنگ ها یا رنگ های عمومی هستند یعنی همه ی باکتری ها را یکسان رنگ می کنند و یا رنگ های اختصاصی که فقط یک گروه از باکتری ها را به رنگ خاص درمی آورد.

مورفولوژی باکتری ها را می توان به دو صورت مورد بررسی قرار داد یکی به صورت زنده که یا از رنگ استفاد نمی شود و یا از رنگ های حیاتی مثل قرمز خنثی برای رنگ آمیزی باکتری ها استفاده می شود و دیگری به صورت مرده یا به عبارتی فیکس شده که از رنگ ها و روش های مختلفی برای رنگ آمیزی گسترش باکتری استفاده می شود.

تقسیم بندی رنگ ها:

رنگ ها از نظر نوع ترکیب مواد رنگی به دو گروه رنگ های ساده و رنگ های مرکب تقسیم می شوند.

الف)رنگ های ساده:این دسته از رنگها از یک ماده ساخته شده اند

ب)رنگ های مرکب:این گروه از رنگ ها از چند دسته مواد تشکیل شده اند

در تقسیم بندی دیگر رنگ ها را بر اساس میل ترکیبی آنها با اجزا یاخته تقسیم بندی می کنند. در رابطه با این امر رنگ ها از نظر گرایش به اجزا یاخته یا رنگ دوستی هسته و سیتوپلاسم به سه دسته تقسیم می شوند:

۱-      رنگ های بازی یا هسته ای : این رنگ ها اصولا یا DNA و یا RNA یاخته ترکیب می شوند.از انواع رنگ های بازی می توان کریستال ویوله , فوشین ,آبی متیلن و سبز متیل را نام برد.کریستال ویوله  که بار الکتریکی  مثبت دارد  به وسیله باکتری دارای بار الکتریکی منفی جذب می شود و آن را رنگ می کند.

۲-      رنگ های اسیدی :این رنگ ها شامل سافرانین و فوشین اسیدی و قرمز کنگو هستند و ترکیبات بازی یاخته و اصولاٌ پروتئین های بازی را رنگ می کنند.

۳-      رنگ های خنثی : سودان سیاه رنگی است که در چربی محلول است و غالباٌ برای مشخص کردن قطرات چربی و موقعیت آنها در باکتری ها به کار می رود.

در میکروب شناسی غالباٌ از سه نوع رنگ آمیزی استفاده می شود.

الف) رنگ آمیزی ساده

ب) رنگ آمیزی افتراقی

ج) رنگ آمیزی مخصوص

الف) رنگ آمیزی ساده :

در این نوع رنگ آمیزی از یک نوع رنگ استفاده می شود و از این روش می توان برای رنگ کردن کامل سلول یا ساختارهای ویژه آن استفاده کرد. آبی متیلن غالباٌ برای رنگ آمیزی ساده باکتری های فیکس شده  به کار می رود و آنها را به رنگ آبی در می آورد.از رنگ های دیگری چون کریستال ویوله و کربول فوشین نیز می توان برای رنگ آمیزی ساده استفاده نمود.گاهی یک رنگ ساده به عنوان رنگ منفی به کار می رود که در این ارتباط می توان به رنگ آمیزی منفی در رابطه با تشخیص کپسول اشاره نمود که زمینه رنگ می گیرد در حالی که کپسول بدون رنگ مشخص می شود.رنگ آمیزی ساده به دو روش می تواند انجام بگیرد:

الف-۱) رنگ آمیزی ساده به روش مثبت (آبی متیلن یا کریستال ویوله )

۱-      ابتدا توسط یک لوپ پلاتینی از کلنی یا سوسپانسیون باکتری های موجود یک گسترش بیضی شکل بر روی یک لام تمیز و غیر چرب تهیه نمایید و سپس تا گسترش مذکور در مجاورت هوا خشک شود. گسترش خشک شده را با عبور دادن لام طی ۲ تا ۳ بار از میان شعله فیکس نمایید.هدف از فیکس کردن گسترش چسباندن محکم باکتری های موجود در گسترش به سطح لام می باشد. که این امر به واسطه انعقاد قسمتی از پروتئین های باکتریایی فراهم می گردد. این امر از شسته شدن گسترش در حین رنگ آمیزی جلوگیری می کند.

۲-      چند قطره از محلول رنگی آبی متیلن را روی گسترش میکروبی ریخته و پس از دو دقیقه آن را با آب مقطر بشویید.

۳-      اجازه دهید تا لام در مجاورت هوا خشک شود.پس از آن در زیر میکروسکوپ به مطالعه ی آن بپردازید.

الف-۲) رنگ آمیزی ساده به روش منفی (مرکب چین یا نگروزین )

همانطوری که قبلاٌ اشاره شد غالباٌ از این روش جهت تشخیص کپسول استفاده می شود که روش آن به ترتیب زیر است:

۱-      ابتدا مقداری از نمونه باکتریایی را در یک لوله آزمایش یا حجمی برابر با مرکب چین یا نگروزین مخلوط نمایید.

۲-      توسط لوپ مقداری از این سوسپانسیون را بر روی لام گذارده و یک گسترش از آن تهیه نمایید.

۳-      اجازه دهید تا گسترش خشک شود سپس توسط میکروسکوپ به مطالعه آن بپردازید در این رنگ آمیزی کپسول با کتری به صورت یک هاله بی رنگ در زمینه تیره مشخص می شود

ب) رنگ آمیزی افتراقی:

رنگ آمیزی است که باکتری های مختلف در برابر آن واکنش مختلفی نشان می دهند و از این طریق می توان آنها را طبقه بندی و مورد شناسایی قرار داد . بهترین روش رنگ آمیزی افتراقی در باکتری شناسی رنگ آمیزی گرم می باشد.

این رتگ آمیزی در سال ۱۸۸۴ توسط پزشک دانمارکی کریستین گرم ابداع گردید. در این رنگ آمیزی باکتری ها به دو گروه تقسیم می شوند: باکتری های گرم مثبت که به رنگ بنش ظاهر می شوند و باکتری های گرم منفی که به رنگ صورتی نمایان می شوند.

در این رنگ آمیزی کریستال ویوله به عنوان رنگ اولیه عمل می کند نمایان می شوند.

در این رنگ آمیزی کریستال ویوله به عنوان رنگ اولیه عمل می کند و به دیواره سلولی باکتری متصل می شود.این اتصال به واسطه کمپلکسی که با (ید) لوگل ایجاد می کند تثبیت می گردد, در واقع ید به عنوان یک موردانت عمل می کند چرا که میل ترکیبی یا جاذبه بین سلول و رنگ را افزایش داده و به نحوی به تثبیت رنگ روی سلول کمک می کند.برخی از گونه های باکتریایی این توانایی را دارند که حتی پس از اضافه کردن رنگ بر ( الکل یا استن ) رنگ کریستال ویوله را حفظ می کنند لذا در رنگ آمیزی گرم به رنگ بنفش در می آیند. این امر به آن علت است که در دیواره باکتری های گرم مثبت ضخیم بودن لایه پپتیدوگلیکان و کم بودن مقدار چربی مانع از نفوذ الکل به دیواره و در عین حال مانع از خروج رسوب رنگی از دیواره می گردد. این در حالی است که دیواره ی سلولی باکتری های گرم منفی به علت وجود مقادیر زیاد چربی و نازک تر بودن لایه پپتیدوگلیکان پس از اضافه نمونه رنگ بر رنگ کریستال ویوله را از دست می دهد و در این موارد بعد از اضافه کردن سافرانین در مرحله آخر به رنگ صورتی در می آیند

ب – ۱) رنگ آمیزی گرم به روش هوکر(Hucker )

1-      ابتدا از باکتری مورد نظر یک گسترش نازک تهیه کرده و در هوای آزمایشگاه اجازه دهید تا خشک شود.

۲-      گسترش مذکور را فیکس کنید

۳-      کریستال ویوله را به مدت ۱ دقیقه روی لام قرار دهید

۴-      لام را با آب مقطر شستشو دهید

۵-      محلول لوگل را به مدت ۱ دقیقه روی لام اثر دهید

۶-      لام را با آب شستشو دهید

۷-      از محلول ۲۵ درصد سافرانین به مدت ۲۰ ثانیه بر روی لام استفاده کنید

۸-      لام را با آب مقطر شسته و پس از خشک شدن آن در زیرر میکروسکوپ به مطالعه آن بپردازید

باید دانست که شرایط محیط (مانند PH ,مواد غذایی ,سن باکتری) در رنگ پذیری باکتری ها موثرند.برخی از باکتری های گرم مثبت پس از چند روز رشد در محیط غذایی ممکن است در رنگ آمیزی گرم به صورت گرم منفی درآیند همچنین اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر زیاد شود ممکن است باکتری های گرم مثبت رنگ اولیه خود را از دست بدهند و به رنگ صورتی درآیند.

ج)رنگ آمیزی مخصوص

از رنگ آمیزی مخصوص جهت مشاهده و بررسی برخی باکتری های خاص و اجزاء داخلی و جانبی آنها استفاده می شود.در این بخش به رنگ آمیزی های خاصی چون زیل نلسون ,لیفسون,شیفر فولتون و آلبرت می توان اشاره نمود

(ج – ۱ ) رنگ آمیزی زیل نلسون

برخی از باکتری ها (باسیل سل ,,جذام و برخی از جنس های نوکاردیا )به واسطه دارا بودن میزان بالایی از چربی به آسانی به روش های معمولی رنگ آمیزی نمی شوند بلکه برای این امر به یک رنگ و حرارت قوی و زمان بیشتری جهت نفوذ رنگ به داخل پیکرشان نیاز دارند.به واسطه این نوع رنگ آمیزی این باکتری ها حتی توسط اسیدهای معدنی و یا اسید الکل رنگ زدایی نمی شوند که به همین جهت واژه اسید فست به آنها اطلاق می گردد.این خاصیت اجاززه می دهد که باکتری ها حتی به تعداد کم در گسترش رنگ شده قابل تشخیص باشند.ترتیب رنگ آمیزی زیل نلسون به قرار زیر است:

۱-      یک گسترش ضخیم و یکنواخت از نمونه تهیه و آن را در هوا خشک کرده و سپس توسط شعله فیکس نمایید.

۲-      یک کاغذ صافی به ابعاد ۲*۴ سانتی متر یا کمی کوچکتر از لام فراهم کنید.این کاغذ بایستی اسمیر (گسترش ) را بپوشاند تا از رسوب رنگ روی جلوگیری کند.

۳-      تمام سطح گسترش را با کربول فوشین (رنگ بازی ) زیل نلسون بپوشانید و به آرامی از سطح زیرین لام توسط شعله حرارت دهید.در زمان حرارت دادن لام بایستی میزان حرارت آنقدر باشد که سطح لام فقط بخار بلند شود و نبایستی رنگ روی لام بجوشد و یا خشک شود در صورتی که به علت حرارت و بخار شدن رنگ میزان رنگ کاهش یابد می توان مجددا روی لام رنگ اضافه کرد

۴-      زمان تأثیر رنگ روی گسترش ۵ دقیقه است بعد از آن کاغذ را برداشته و لام را با آب بشویید

۵-      توسط اسید الکل رنگ زدایی کنید یا از محلول مزبور آنقدر روی لام قطره قطره می ریزند تا آخرین قطره خارج شده از روی لام شفاف باشد.

۶-      از رنگ آبی متیلن به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه روی گسترش بریزید

۷-      لام را شسته در هوا خشک کنید و با عدسی روغنی به مطالعه پردازید

در این رنگ آمیزی باکتری سل به صورت باسیل ظریف و قرمز رنگی در زمینه آبی مشخص می شود

(ج – ۲) رنگ آمیزی تاژک به روش لیفسون

تاژک ها ضمائمی هستند بسیار شکننده که نسبت به حرارت حساس می باشند و جهت رنگ آمیزی باید با دقت فراوان با انها کار کرد و نیاز به روش های مخصوص می باشد . تاژک ها با میکروسکوپ های معمولی قابل مشاهده نیستند و به این منظور باید قطر انها افزایش یابد تا قابل رویت گردند.این عمل با استفاده از پوشاندن سطح آنها توسط یک ماده موردانت انجام می شود.این ماده اجازه می دهد تا مواد رنگی به خوبی روی آن تثبیت شده و ساختمان نخی شکل تازک بعد از رنگ آمیزی قابل مشاهده گردد.

۱-      برای رنگ آمیزی تاژک معمولا کشت ۱۸ الی ۲۴ ساعته باکتری بر روی محیط آگاردار مناسب می باشد که پس از مدت مذکور بر سطح محیط کشت ۲ تا ۳ میلی لیتر آب مقطر سترون ریخته و محلول را در لوله سترون بریزید و ان را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه قرار دهید و سپس از قسمت سطحی این سوسپانسیون برداشت کنید

۲-      رنگ تازه تهیه شده لیفسون را اختیار کنید

۳-      برای رنگ آمیزی روی لام مورد نظر یک مستطیل با ماژیک رسم کنید به طوری که ۳/۲ لام را شامل شود

۴-      ۱/۰ میلی لیتر از محلول باکتری را از سطح رویی سوسپانسیون میکروبی برداشته و در یک گوشه مستطیل روی لام قرار دهید

۵-      لام را با زاویه ۳۰ تا ۴۰ درجه کج کنید تا محلول از یک طرف لام به سمت دیگر برود لام را به حالت کج در دمای آزمایشگاه خشک کنید. این لام پس از خشک شدن نیازی به ثابت کردن ندارد

۶-      قسمت مستطیلی لام را کاملا با رنگ لیفسون بپوشانید و حدود۱۰ تا ۱۵ دقیقه صبر کنید

۷-      لام را با آب بشویید برای شستشو بهتر است آب را با پیپت به آرامی روی گسترش بریزید

۸-      لام را در دمای آزمایشگاه خشک کنید و آن را توسط عدسی روغنی مورد مطالعه قرار دهید در این حالت تاژک به رنگ صورتی کم رنگ و جسم باکتری پررنگ تر دیده می شود

یاد آوری : از نمونه موارد آزمایش می توانید قطره معلق نیز تهیه کنید تا از متحرک بودن کشت مطمئن شوید

(ج – ۳)رنگ آمیزی گرانول های ولوتین (دانه های متاکروماتیک ) به رو آلبرت

از این رنگ آمیزی جهت تشخیص باسیل کورینه باکتریوم (عامل بیماری دیفتری ) و دیگر اعضا کورینه باکتریوم ها استفاده می شود چرا که این باکتری ها در دیواره خود دارای دانه های متاکروماتیک هستند.ترتیب این رنگ آمیزی به شرح زیر است:

۱-      یک گسترش از باکتری مذکور تهیه و پس از فیکس نمودن آن از محلول A به مدت ۵ دقیقه بر روی آن اثر دهید

۲-      رنگ را از روی لام بدون شستشوی آن با آب دور بریزید

۳-      محلول B را روی لام به مدت ۱ دقیقه اثر دهید

۴-      لام را با آب شسته  در هوا خشک کرده و توسط عدسی روغنی به مطالعه بپردازید

در این آزمایش گرانول های متاکروماتیک در دو سر باکتری به رنگ سبز تیره تا سیاه و پیکر باکتری به رنگ سبز روشن مشاهده می گردند

محلول A  شامل :

آبی تولوئیدین ۱۵ صدم گرم,سبز مالاشیت ۲ صدم گرم,الکل اتیلیک ۹۵ درصد ۲ میلی لیتر ,آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

محلول B شامل :

یدور پتاسیم ۳ گرم ,ید ۲ گرم ,آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

رنگ آمیزی گرم

این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتیبه ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به      رنگ قرمز مشاهده می شود

گرچه هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به ۵ گروه تقسیم بندی می کنند:

۱-        میله ای (باسیل ) گرم مثبت ۲- میله ای گرم منفی ۳- کوکوس (گرد) گرم مثبت ۴- کوکوس گرم منفی ۵- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این ۵ گروه قرار داده و با اطمینان ۴ گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

۱-        باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

۲-        گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

۳-        باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

۴-        باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

 کاربرد رنگ آمیزی گرم

از رنگ‌آمیزی گرم به دو جهت استفاده می‌شود:

• شناسایی جنس باکتری
• انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب (باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با باکتری‌های گرم منفی نسبت به پنی‌سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند(

با این حال همهٔ باکتری‌ها را نمی‌توان با رنگ‌آمیزی گرم مشاهده نمود

روش انجام  آزمایش:

۱- رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد

۲- پس از شستشو گسترش با آب به مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

۴- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

قند خون “اندازه گیری قند خون به روش اورتوتولوئیدین”

در خون قندهای مختلف وجود دارند که همه آنها را تحت عنوان کربوهیدراتها می‌نامند. از این اینها قنداهای کربنی گلوکز را به علت تشکیل بخش اعظم این کربوهیدرات

و اینکه همه این کربوهیدراتها در آخر به این قند تبدیل می‌شوند به عنوان قند خون تعریف می کنند

  در شرایط طبیعی غلظت گلوکز خون در محدوده باریکی ، معمولا بین ۹۰ – ۸۰ میلیگرم در دسی لیتر هر روز صبح قبل از صرف صبحانه در شخص ناشتا کنترل می‌شود. این غلظت در حدود ساعت اول بعد از صرف یک وعده غذا به ۱۴۰ – ۱۲۰ میلیگرم در دسی لیتر خون افزایش می‌یابد. اما سیستمهای فیدبکی برای کنترل گلوگز خون غلظت گلوکز را به سرعت (معمولا در ظرف ۲ ساعت بعد از آخرین جذب کربوهیدراتها) به حد طبیعی باز می‌گردانند. بر عکس ، در حالت بی‌غذایی ، بوسیله گلوکونئوژنز در کبد گلوکز مورد نیاز برای حفظ غلظت گلوکز در حد ناشتا را تامین می‌کند. این مقادیر برای بیماران دیابتی قدری بالاتر است.

1. کبد به عنوان یک سیستم بافری مهم برای گلوکز خون عمل می‌کند به این معنی که هنگامی که گلوکز خون به دنبال صرف یک وعده غذا تا غلظت زیادی بالا می‌رود میزان ترشح انسولین نیز افزایش می‌یابد و در حدود ۳/۲ گلوکز جذب شده از روده بلافاصله به گلیکوژن تبدیل شده و در کبد ذخیره می‌شود. در طی ساعات بعد که غلظت گلوکز خون و نیز در این ترشح انسولین کاهش می‌یابد، کبد گلیکوژن را تجزیه و به گلوکز تبدیل می‌کند. این تنظیم در بیماران با اختلالات کبدی تقریبا غیر ممکن است.
2. علاوه بر انسولین ، گلوکاگون نیز در تنظیم مقدار قند خون دخیل است. این هورمون بر عکس انسولین کار می‌کند. بطوری که با کاهش گلوکز خون ترشح گلوکاگون افزایش می‌یابد و برعکس انسولین ، موجب تجزیه گلیکوژن و به سطح نرمال رساندن غلظت گلوکز می‌شود.
3. یک اثر مستقیم کاهش غلظت گلوکز خون تحریک غده هیپوتالاموس و سیستم عصبی سمپاتیک می‌باشد که موجب ترشح اپی نفرین از غدد فوق کلیوی می‌گردد. اپی نفرین بر روی کبد اثر کرده و موجب آزاد سازی گلوکز می‌شود.
4. دو هورمون رشد و کورتیزول نیز در این تنظیم موثرند چرا که مقدار مصرف را بوسیله قسمت اعظم سلولهای بدن کاهش می‌دهند و بجای آن ، گلوکز را به چربی تبدیل می‌کنند.

  چرا حفظ یک غلظت ثابت گلوکز ، اهمیت دارد در حالی که بیشتر بافتها می‌توانند در غیاب گلوکز از چربیها و پروتئینها استفاده کنند؟ پاسخ این است که گلوکز تنها ماده غذایی است که بوسیله مغز ، شبکیه ، اپی‌تلیوم زایای غدد جنسی استفاده می‌شود و بنابراین حفظ غلظت گلوکز خون ، ضروری می‌باشد. به خاطر همین قسمت اعظم گلوکزی که در مرحله بین غذاها از طریق گلوکونئوژنز (ساخت گلوکز از مواد دیگری مثل پروتئینها و چربیها) تشکیل می‌شود.

• گلوکز مقدار زیادی فشار اسمزی در مایع خارج سلولی اعمال می‌کند اگر مقدارش افزایش یابد فشار اسمزی خارج سلول هم افزایش می‌یابد و همین موجب بهم خوردن قدرت ترابری غشای سیتوپلاسمی گردیده و همین خود به نتایج ناخوشایندی چون ادم ، از دست دادن آب سلول و … می‌گردد.
• گلوکز زیادی از طریق ادرار دفع می‌گردد و همراه این مایعات و الکترولیتهای بدن نیز تخلیه می‌شود.
• افزایش دراز مدت سطح گلوکز خون ، موجب آسیب بسیاری از بافتها و بویژه رگهای خونی آنها می‌گردد و همین ممکن است به نتایجی چون حمله قلبی ، سکته مغزی ، بیماریهای کلیوی گردد.

  دیابت قندی ، یک سندرم اختلال متابولیسم کربوهیدرات ، چربی و پروتئین است که توسط یا فقدان ترشح انسولین یا کاهش حساسیت بافتها به انسولین بوجود می‌آید. به دو نوع دیده می شود: وابسته به انسولین که بر اثر فقدان انسولین می‌باشد و غیر وابسته به انسولین ، بر اثر کاهش حساسیت بافتهای هدف به انسولین بوجود می‌آید. به این دومی ، مقاوم به انسولین هم می‌گویند. این بیماری سوخت و ساز گلوکز را در همه انواع سلولها به غیر از سلولهای مغز را دگرگون می‌کند. از علایم دیابت به موارد مقابل می‌توان اشاره کرد: تشنگی بیش از حد ، ادرار کردن زیاد ، خارش بدن ، خستگی ، گزگز دستها و پاها ، کاهش وزن و ایجاد زخمهایی در پاها که به راحتی التیام نمی‌پذیرند. اما در نوع دوم (مقاوم به انسولین) چاقی دیده می‌شود و بنابراین اینها نیاز به رژیم غذایی مناسبی دارند.

  افراد دیابتی که جهت درمان و کنترل بیماری خود از قرصهای پایین آورنده قند استفاده می‌کنند در بعضی مواقع خونشان بطور غیر عادی کاهش می‌یابد. این حالت ممکن است در عدم مصرف قرص هم دیده شود. در این حالت مقدار قند خون به پایین‌تر از ۶۰ میلیگرم نزول می‌کند. شایع‌ترین علت ، بی‌نظمی در ساعات غذا یا فراموش کردن یکی از نوبتهای غذایی است. چرا که باید بین برنامه غذایی ، انسولین موجود و ورزش تعادل باشد. ممکن است کاهش قند خون به دلیل کاهش وزن باشد چرا که با کاهش وزن ، مقاومت انسولینی هم کاهش و همین موجب کاهش قند خون می‌گردد. از علایم کاهش قند خون می‌توان به موارد زیر اشاره کرد: گرسنگی ، لرز ، عصبانیت ، تعریق ، سرگیجه ، ضعف ، تحریک پذیری و تپش قلب و در موارد حادتر فریاد کشیدن، چشم ، خواب آلودگی ، سردرگمی ، عدم تعادل در راه رفتن، تاری دید و سر درد. در این مواقع از غذاهای نشاسته‌ای سریع‌الاثر مثل چند حبه قند ، دو یا سه قاشق مرباخوری شکر ، آب پرتقال (نصف لیوان) ، چند تکه میوه خشک شده ، محلول رقیق قندی و شربتها ، باید استفاده کرد.

  گلوکز ۶- فسفات و سایر قندها به صورت برگشت پذیری با هموگلوبین واکنش نشان می‌دهند بنابراین می‌توان گفت مقدار ساخت گلبول قرمز و نیز سطح قند خون باهم متناسب است. به خاطر همین ، افراد دیابتی در مقایسه با افراد سالم ، مقدار بالایی از هموگلوبین (از نوع A_1c) را دارند. بنابراین اندازه‌گیری سطح هموگلوبین هر چند هفته یکبار می‌تواند در تعیین اینکه آیا سطح گلوکز بیماران دیابتی به حد کافی کنترل شده است یا نه؟ بسیار مفید باشد.

  میزان انرژی مورد نیاز در طول ۲۴ ساعت از ۱۶۰۰ کیلوکالری در حالت استراحت تا ۶۰۰۰ کیلوکالری بسته به شدت فعالیت تغییر می‌کند. و مقدار ذخایر سوختی یک فرد ۷۰ کیلویی ، معادل ۱۶۰۰ کیلوکالری گلیکوژن ، ۲۴۰۰۰ کیلو کالری از پروتئین ، ۳۵۰۰۰ کیلو کالری تری اسیل گلیسرول می‌باشد. بنابراین ، مقدار مواد سوختی این فرد ، نیازهایش را برای ۱ الی ۳ ماه گرسنگی تامین می‌کند. اما ذخایر گلوسیدی بدن ، در عرض یک روز به مصرف می‌رسد. و سریعا مقدارش افت پیدا کرده و نیاز به تامین مجدد دارد. اسیدهای چرب نمی‌توانند به گلوکز تبدیل شوند البته قسمت گلیسرول ساختمان تری اسیل گلیسرولها ، می‌تواند به گلوکز تبدیل گردد، اما مقدار گلیسرول کم است یک منبع عمده دیگر برای گلوکز ، اسیدهای آمینه است که از تجزیه پروتئینها مشتق می‌گردد. در طول گرسنگی ، عضله ، بزرگترین منبع اسیدهای آمینه بشمار می‌رود.

  3 لوله آزمایش آماده میکنیم در یکی از آنها ۰/۱ میلی لیتر نمونه سرم میریزیم ذر لوله ی بعدی۰/۱ میلی لیتر استاندارد گلوکز و در لوله ی سوم ۰/۱ میلی لیتر آب مقطر میریزیم سپس به هر کدام از آنها ۵ میلی لیتر معرف اورتوتولوئیدین اضافه می کنیم.محتویات دون هر یک از لوله ها را خوب مخلوط می کنیم و درب آنها را با پارافیل بسته و به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری قرار می دهیم.پس از اینکه لوله ها سرد شدندOD آنها را در۶۳۰nm می خوانیم

محلول سازی

محلول سازی :

محلول سازی یکی از متداولترین و در عین حال دقیق ترین کارهایی است که در آزمایشگاه انجام میشود. محلول سازی به معنای ساختن محلول مورد نظر و لازم از محلولهای استاندارد میباشد.

محلولی را استاندارد می گویند که در آن ، رابطه بین مقادیر ماده حل‌شده و محلول یا رابطه بین مقدار ماده حل‌شده و حلال بنحوی معلوم باشد. با معلوم بودن مقدار ماده حل‌شونده و مقدار حلال تشکیل دهنده محلول ، غلظت محلول مشخص می‌گردد. بسیاری از واکنش‌ها در حالت محلول انجام می‌شوند و محاسبه‌های کمی برای این‌گونه واکنش‌ها بر مبنای غلظت آنها صورت می‌گیرد. برای بیان غلظت ، روش‌های گوناگونی وجود دارد و محلولهای استاندارد را براساس غلظت بیان می‌کند.

محلولهای استاندارد کاربردهای زیادی دارند، از جمله در تجزیه های تیترسنجی (تیتراسیون) ، واکنش‌های خنثی شدن و واکنش‌های اکسیداسیون-احیا و…

برای محلول سازی باید ابتدا با واحدها و روش های بیان غلظت یک محلول، آشنایی کامل داشته باشید:

محلول درصد جرمی  :

محلولی است که در آن مقداری ماده حل‌شونده در ۱۰۰ گرم محلول ، حل شده باشد. ۱۰۰× (جرم محلول/جرم ماده حل شونده )= درصد جرمی در صورت و مخرج باید از یک نوع یکای جرم استفاده شود. یعنی هر دو باید برحسب میلی‌گرم ، گرم یا کیلوگرم بیان شوند. مثلا ، بر روی بر چسب محلول شست وشوی دهان نوشته می شود: “محلول استریل سدیم کلرید ۹/۰ درصد برای شستشو”. عبارت “سدیم کلرید ۹/۰ درصد” یعنی در ۱۰۰ گرم از این محلول ۹/۰ گرم سدیم کلرید وجود دارد و بقیه آن آب است. برای محلول‌های بسیار رقیق ، معمولا غلظت بر حسب قسمت در میلیون (ppm) بیان می‌شود. (۶ ^۱۰× جرم محلول) / جرم ماده حل شونده = ppm اگر حلال ، آب باشد و مقدار ماده حل‌شونده چنان کم باشد که چگالی محلول هم‌چنان g.mL-1 1,0 باقی بماند، در اینصورت رابطه به قرار زیر خواهد بود: لیتر محلول / میلی گرم ماده حل شونده≈ppm

از ppm برای بیان مقادیر بسیار کم کاتیون‌ها و آنیون‌ها در آب دریا ، بدن جانداران ، بافت‌های گیاهی و میزان آلاینده‌های هوا و بطور کلی ، در مواردی که مقدار ماده حل‌شونده خیلی جزئی باشد، استفاده می‌شود. محلول گرم در لیتر (غلظت معمولی-C)

در این محلول‌ها ، مقداری ماده حل‌شونده در یک لیتر محلول وجود دارد. حجم محلول به لیتر/مقدار ماده حل شونده به گرم= C

برای مثال ، اگر در ۲۰۰ میلی‌لیتر از محلولی به اندازه ۴ گرم پتاسیم کلرید حل‌شده باشد، غلظت معمولی این محلول ، ۲۰ گرم در لیتر خواهد بود.

ابتدا میلی لیتر به لیتر تبدیل شود: ۲۰۰ml*1 L / 1000 ml=0.2 L

و سپس جاگذاری در فرمول شود: C=4g / 0.2 L=20 g.L-1 محلول مول در لیتر (مولار CM)

غلظت مولار رایج‌ترین روش برای بیان غلظت است و محلول مولار، محلولی است که در هر لیتر آن، به اندازه یک مول ماده حل‌شونده ، حل شده باشد. مانند محلول یک مول بر لیتر لیتیم کلرید که در آن ، یک لیتر محلول دارای یک مول لیتیم کلرید است.

حجم محلول (لیتر)/مقدار ماده حل شونده (مول)= غلظت مولار (M) محلول مولال (m)

محلولی که در آن یک مول ماده حل‌شونده در یک کیلوگرم حلال حل شده باشد، محلول مولال نامیده می‌شود. از غلظت مولال در مطالعه خواص کولیگاتیو محلول‌ها بکار می‌رود.

کیلوگرم حلال/مقدار ماده حل شونده (مول)= غلظت مولال (m) برای مثال ، اگر در ۲۰۰ گرم آب خالص ، ۰,۰۳ مول کلرید پتاسیم حل شده باشد، مولالیته محلول عبارت خواهد بود:

ابتدا باید گرم محلول به کیلوگرم تبدیل شود:

۲۰۰g*1 Kg/1000 g=0,2 Kg کیلوگرم حلال مولال m=0,03(mol)/0,2Kg=0,15

محلول نرمال (N) محلول نرمال ، محلولی است که یک اکی والان گرم ماده حل‌شونده در یک لیتر آن و یا یک میلی‌اکی‌والان گرم در هر لیتر آن حل شده باشد. مفهوم اکی والان گرم: مقدار وزن اکی والان مواد مختلف طبق رابطه زیر به دست می‌آید:

E=M/n

که M ، جرم مولکولی و n (ظرفیت) برای مواد مختلف به قرار زیر بدست می‌آید:

مقدار n برای اسیدها برابر تعداد هیدروژن‌های اسیدی و برای بازها، برابر تعداد -OH ، برای نمک‌ها برابر ظرفیت فلز ضرب‌در تعداد فلز و برای واکنش‌های اکسایش- کاهش برابر درجه کاهش            یا اکسایش است. با بدست آوردن مقدار E (وزن اکی والان) می‌توان تعداد اکی‌والان را از رابطه زیر حساب کرد:

وزن اکی والان/جرم ماده برحسب گرم = m/E = تعداد اکی والان در نتیجه، نرمالیته یک محلول بیانگر تعداد اکی‌والان‌ها در یک لیتر محلول یا تعداد میلی‌اکی‌والان در هر میل

محلول سازی از محلول های غلیظ آزمایشگاه

معمولاً در آزمایشگاه محلولها به صورت غلیظ و با درصد خلوص مشخص و استانداردی وجود دارد و برای تهیه محلول های رقیق تر باید از آن ها استفاده کرد.

برای این کار از روابط رقیق سازی استفاده می کنیم :

 در رابطه بالا نیاز است که نرمالیته یا مولاریته محلول غلیظ موجود در آزمایشگاه را تعیین کنیم.

برای تعیین نرمالیته از فرمول زیر استفاده می کنیم :

 نرمالیته محلول غلیظ را بدست آوردیم. در رابطه اول فقط حجم محلول غلیظ (v₂) مجهول است که محاسبه می شود و فقط کافی است این مقدار (v₁) را از محلول غلیظ برداشته و به حجم مورد نظر (v₂) برسانیم.

برای تعیین نرمالیته و مولاریته محلول های آزمایشگاهی می توانید از جدول زیر استفاده کنید. که در این صورت فقط به رابطه اول نیاز خواهید داشت.

 تذکر: در مورد اسیدهای غلیظ و قوی مثل اسید سولفوریک همیشه اسید را به آب اضافه می کنیم. (قبل از اضافه کردن اسید مقداری  آب مقطر در بالون بریزید و سپس اسید را اضافه کنید).

 محلول سازی از مواد جامد آزمایشگاه

 فقط کافی است مقدار ماده جامد بدست آمده را در مقداری آب مقطر حل کرده و به حجم مورد نظر برسانید.

 تذکر : در مورد برخی مواد جامد که رطوبت جذب می کنند باید دقت شود که از فرمول نوشته شده بر روی برچسب ظرف ماده جرم مولکولی محاسبه شود. مثلاBaCl₂ . 2H₂O به جرم مولکولی آن دو ملکول آب (۳۶gr) اضافه شده است که باید در محاسبات لحاظ شود.

روش انجام آزمایش:

لف) اگر ماده خالص مایع باشد:

ابتدا با استفاده از محاسبات میزان مقدار موردنیاز HCl را بدست می آوریم:

cc50 HCl  ۱/۰ مولار                                                                        d = 1.16

a = 37

M = 36.5

با استفاده از پیپت مدرج ۰٫۴۲cc HCl بر می داریم و در بالون ژوژه ای که در آن تا نیمه آب ریخته ایم، می ریزیم. سپس درپوش بالون را گذاشته و با دست ابتدا و انتهای آن را گرفته و بصورت معکوس بالون را گردانیده به طوری که جای درپوش و انتهای بالون تغییر کند (مطابق شکل). این حرکت را برای مخلوط شدن بهتر HCl و آب چندبار تکرار می نمائیم.

ب) اگر ماده اولیه جامد باشد:

ابتدا با استفاده از محاسبات مقدار موردنیاز سود را بدست می آوریم:

ابتدا شیشه ساعت را روی ترازو گذاشته و نشانگر روی ترازو را صفر کرده و مقداری NaOH جامد روی شیشه ساعت ریخته و به اندازه ۲/۰ گرم از آن را را اندازه گیری نموده، سپس بوسیلة قاشقک فلزی مقدار اندازه گیری شدهNaOH  را برداشته و داخل بالون ریخته و cc50 آبی که از قبل داخل بشر ریخته ایم را به آن اضافه کرده و بکمک همزن شیشه ای مخلوط می کنیم به طوری که NaOH  جامد کاملاً در آب حل شود. سپس به وسیلة آبفشان به آن آب اضافه می نمائیم.

نکته : با توجه به این که سطح مایعات در داخل بالون ژوژه به شکل مقعر میباشد، باید توجه داشت که پس از افزودن آب تا خط نشانه، تقعر مایع داخل بالون روی خط نشانگر قرار گیرد نه طرفین آن.

استخراج اسید نوکلئیک از مخمر

مقدمه:

نخستین گام در بررسی مولکولی ساختار ژنتیک سلول ها دسترسی به مادة ژنتیک می باشد. اصول استخراج مادة ژنتیک از سلول های مختلف (باکتری ها، سلول های گیاهی و سلول های جانوری) نسبتا یکسان است و تنها در برخی از جزئیات تفاوت هائی وجود دارد. استخراج اسید های نوکلئیک شامل دو مرحله تهیه عصارة سلولی و خالص سازی می باشد.

تهیه عصاره سلولی برای تهیه عصارة سلولی به تعداد زیادی سلول نیاز است. عموما سلول ها با تکثیر در محیط کشت ویا مستقیما از بافت ها (مانند بافت خون ) تأمین می شوند. سپس باید دیواره و غشاء سلول ها از بین بروند تا محتویات آنها آزاد شوند. برای تخریب دیواره یا غشاء سلولی، روش های فیزیکی و شیمیایی مختلفی بکار میرود. از روش های فیزیکی می توان به شوک اسمزی، سائیدن سلول های یخ زده و استفاده از امواج صوتی یا سونیکیشن اشاره کرد. در سونیکیشن، طول موج و شدت امواج صوتی به کار گرفته شده به نوع سلول و کاربردی که از عصارة سلول مورد نظر است، بستگی دارد. در روش های شیمیایی از آنزیم ها و موادی که باعث تخریب دیواره و غشاء می شوند استفاده می شود. برای مثال، برای شکستن دیوارة باکتری ها از آنزیم لیزوزیم یا اتیلن دی آمین تتراستات (EDTA) یا مخلوطی از آنها استفاده می شود. لیزوزیم با عمل آنزیمی خود باعث تجزیه پپتید و گلیکان دیوارة سلولی می شود و EDTA که یک عامل شلات کننده است با حذف یون های فلزی مانند Ca2+ وMg2+ که در استحکام دیواره نقش دارند، دیواره را سست می کند. به علاوه EDTA با حذف یون های فلزی که به عنوان گروه پروتستتیک در آنزیم های تجزیه کننده اسید های نوکلئیک عمل می کند، مانع تجزیه این مواد می شود. در سلول های جانوری بعلت فقدان دیواره سلولی، با یک شوک اسمزی ساده می توان غشاء سلول ها را شکست. با اینحال اغلب از موادی مانند سدیم دود سیل سولفات (SDS)، دو دسیل سارکوزین و تریتون- X100 که غشا را در خود حل می کنند استفاده می شود. SDS همچنین باعث پایداری اسیدهای نوکلئیک می شود. مراحل تهیه عصاره سلولی باید در محلول های محافظت کننده اسیدهای نوکلئیک که معمولا حاوی بافرتریس هیدروکلرید (Tris-HCl)، SDS و EDTA است انجام شود تا کمترین آسیب به مادة ژنتیک برسد. برای استخراج مادة ژنتیک سلول های انسانی، معمولاً از سلول های سفید خون که یک تا سه ساعت مانده اند یا خون منجمد، سلول های کشت یافته مانند کشت فیبروبلاست ها، کشت سلول های پرز های جنینی (CVS) یا کشت سلول های مایع آمنیوتیک استفاده می شود.

خالص سازی DNA برای خالص سازی DNA برحسب نوع سلول و کاربرد مورد نظر، روش های مختلفی ابداع شده است. روش های مزبور از اصول یکسانی تبعیت می کنند که شامل رسوب دادن مرحله به مرحله ناخالصی ها و استخراج DNA خالص می باشد. در این روش ها ابتدا با کمک مواد واسرشت کننده پروتئین ها نظیر فنل، این مواد از عصاره سلولی حذف می شوند. سپس DNA در فاز قطبی (آبی) بصورت محلول استخراج می شود. اگر مقدار پروتئین ها زیاد باشد می توان قبل از مرحله فوق پروتئین ها را با آنزیم های تجزیه کننده مانند پروتئیناز k تجزیه و حذف نمود . پس از جدا کردن فاز آبی، می توان با اضافه کردن الکل هائی نظیر اناتول یا ایزوپروپانول در حضور کاتیون Na+ یا آمونیوم، اسیدهای نوکلئیک را رسوب داد. در سلول های گیاهی و سلول های بافت کبد که مقدار هیدرات های کربن زیاد است برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک از CTAB و محلول نمک استفاده می شود. این محلول فقط باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود و پلی ساکاریدها بصورت محلول باقی می مانند. رسوبی که به روش های فوق بدست می آید حاول مخلوطی از RNA و DNA است. برای خالص سازی DNA می توان با اضافه کردن ریبونوکلئاز، RNA را هیدرولیز کرده و DNA خالص بدست آورد. امروزه شرکت های مختلف تهیه کننده مواد بیولوژی مولکولی اقدام به تهیه کیت هایی برای استخراج اسید های نوکلئیک از منابع مختلف سلولی نموده اند که در صورت عدم وجود محدودیت مالی در آزمایشگاه می توان با استفاده از کیت های مزبور در مدت زمان کم و با بازده نسبتا بالائی اقدام به تهیه اسید های نوکلئیک با درجه خلوص بالا نمود. به علاوه سیستم های روبوتیک مختلفی اختراع شده اند که روزانه قادر به استخراج هزاران نمونه از اسید های نوکلئیک از نمونه های مختلف میکروبی، گیاهی و حیوانی می باشند.

روش انجام آزمایش:

۵/۲ میلی لیتر NaOH  ۱% را در آب مقطر حل می کنیم سپس ۵/۱ گرم مخمر را به آرامی به محلول اضافه می کنیم و آنها را با هم مخلوط می کنیم و به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری قرار می دهیم.مخلوط را پس از سرد کردن با کاغذ صافی صاف می کنیم و با اسید استیک نرمال PH آن را اسیدی می کنیم.۵ میلی لیتر مخلوط الکل-اسید کلریدریک به آن اضافه می کنیم وخوب هم میزنیم.محلول رویی را دور می ریزیم و رسوب را حدود ۲ الی ۳ بار با الکل ۹۶ درجه می شوییم رسوب باقی مانده DNA  است

اوره خون “اندازه گیری اوره خون”

مقدمه

واکنشهای مختلفی که در داخل سلول انجام می‌گیرد به تشکیل ترکیبات زاید در سلول منتهی می‌شود. خروج این ترکیبات از سلول باعث تغییر ترکیب و خواص محیط اطراف سلول می‌شود. به تدریج آن را برای ادامه زندگی نامساعد می‌باشد. در اثر تخریب اسیدهای آمینه که طی آن گروه یا گروههای آمین اسید آمینه طبیعی بدن موجودات طی اکسایش برداشته می‌شوند و در صورتی که جهت سنتز ترکیبات نیتروژن‌دار جدید یا در سایر کنش و واکنشهای متابولیسمی یاخته به مصرف نرسند مجتمع شده و به شکل قابل ترشح درمی‌آیند.

اشکال دفع نیتروژن در موجودات زنده

در جانوران مختلف ، نیتروژن گروه آمینو به یکی از سه شکل اصلی زیر ترشح می‌شود. اکثر موجودات آبزی نیتروژن را به صورت آمونیاک (NH₃) آزاد می‌سازنند. آمونیاک ترکیبی بسیار سمی است ولی به علت محلول بودن در آب سمیت آن برای موجود زنده کاهش می‌یابد. پرندگان و برخی از خزندگان نیتروژن را به صورت اسید اوریک ترشح می‌کنند. اسید اوریک سمی نیست ولی در آب نامحلول است و به همین دلیل به صورت جاودانه موجود دفع می‌شود. سایر موجودات ، نیتروژن را به صورت اوره به خارج ترشح می‌کنند اوره نسبت به NH₃ سمیت کمتری دارد و در آب نیز حل می‌شود. خون مواد نیتروژن‌دار مثل اوره و اسید اوریک را می‌گیرد و در حین گردش در بدن همواره از کلیه‌ها می‌گذرد. در کلیه‌ها مواد نیتروژن‌دار زاید آب اضافی و مواد دفعی دیگر از خون گرفته شده و به خارج دفع می‌گردد. غلظت اوره در پلاسمای خون ۰٫۰۳ و مقدار آن را در ادرار ۲ درصد است.

چرخه اوره

در جانورانی به نام اورئوتلیک ، آمونیاک حاصل از ‌اسید آمینه (گروه آمین به علت داشتن ‘pk بالا در PH خون به صورت یون آمونیوم است)، در کبد بوسیله یک مکانیسم چرخه‌ای به اوره تبدیل می‌شود. ‌این چرخه نخستین بار توسط که بس و همکارانش کشف و به نام چرخه اوره نامگذاری شد. سه ترکیب اصلی این چرخه اسید امینه‌ها هستند. این سه ترکیب عبارتند از: آرژنین که جزء اسیدهای آمینه اصلی سازنده پروتئینها است. اورنیتین و سیترولین دو اسید آمینه کمیاب‌اند و منحصرا در‌این چرخه وارد می‌شوند. آمونیاک حاصل از اسید آمینه در مجاورت ATP با CO₂ ترکیب شده و ترکیبی به نام کربومویل فسفات می‌دهد.

مراحل چرخه اوره

مرحله اول

آغاز چرخه با اورنیتین است که در مجاورت کربومویل فسفات به سیترولین مبدل می‌شود. آنزیم اورنتین ترانس کربامیلاز واکنش را کاتالیز می‌کند. این مرحله در ماتریکس میتوکندری انجام می‌گیرد مراحل بعدی در سیتوسل صورت می‌گیرد.

مرحله دوم

مرحله‌ای است که در طی آن سیترولین با مصرف انرژی با آسپارتات ترکیب شده و آرژینینو سوکسینات می‌دهد. آنزیم آرژینییو سوکسینات واکنش را کاتالیز می‌کند.

مرحله سوم

مرحله تبدیل آرژینینو سوکسینات به آرژنین تحت اثر آنزیم لیاز است طی‌این واکنش فومارات – که یکی از واسطه‌های چرخه کربس است نیز حاصل می‌شود.

مرحله چهارم

در ‌این مرحله تحت اثر آنزیم آرژیناز ، اوره فرآورده آغازگر چرخه اوره یعنی اورنیتین ساخته می‌شود.

نقصهای ژنتیکی چرخه اوره میتوانند

زندگی افراد را به خطر اندازند

افراد مبتلا به نقصهای ژنتیکی در هر کدام از آنزیمهای شرکت کننده در تولید اوره ، نمی‌توانند غذاهای غنی از پروتئین را تحمل کنند. اسیدهای آمینه‌ای که بیش از توان مورد نیاز روزانه برای سنتز پروتئین خورده می‌شوند، در کبد دآمینه شده و تولید آمونیاکی می‌کنند که نمی‌تواند به اوره تبدیل و در گردش خون منتقل گردد. آمونیاک شدیدا سمی است. درمانهای متعدی برای مبتلایان به نقص در چرخه اوره صورت می‌پذیرد. تجویز دقیق اسیدهای آروماتیک بنزوات یا فنیل استات در رژیم غذایی می‌تواند به کاهش مقادیر آمونیاک خون کمک کند.

سندرم اورمی

دیالیز در مبتلایان به نارسایی حاد کلیه وقتی سطح نیتروژن ، اوره سرم (SUN) آنها به ۱۰۰ – ۷۰ میلیگرم در دسی‌لیتر می‌رسد. یا هنگامی که کلیرانس کراتینین آنها به کمتر از ۲۰ – ۱۵ میلی‌لیتر در دقیقه کاهش می‌یابد، شروع می‌شود. به مجموعه نشانه‌ها و علایمی که به علت آثار سمی افزایش مواد نیتروژنی و دیگر مواد زاید در خون ایجاد می‌شود، سندرم اورمی گویند. وضعیت عقلانی و روانی این بیماران تغییر می‌کند و عاقبت دچار گیجی شده و نهایتا به اغما می‌روند روش انجام آزمایش: ۳ لوله آزمایش آماده می کنیم در لوله اول ۱/۰ میلی لیتر نمونه سرم .۲ میلی لیتر معرف دی استیل مونو اکسیم و ۳ میلی لیتر اسید سولفوریک ودر لوله دوم ۱/۰ میلی لیتر آب مقطر .۲ میلی لیتر معرف دی استیل مونو اکیسم و ۳ میلی لیتر اسید سولفوریک و در لوله سوم  ۰/۰۵ میلی لیتر استاندارد اوره .۲میلی لیتر معرف دی استیل مونو اکسیم و ۳ میلی لیتر اسید سولفوریک می ریزیم.محتویات درون هریک از لوله ها را خوب مخلوط می کنیم و به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری قرار می دهیم.سپس لوله ها را با آب سرد می کنیم و OD آنها را در ۵۲۰nm می خوانیم.

کلسترول “اندازه گیری کلسترول خون”

مقدمه: کُلِستِرول (به انگلیسی: Cholesterol)، یکی از مولکول‌های زیستی و از دسته چربی‌ها (لیپیدها) است. این مولکول ساختار چندحلقه‌ای (آروماتیک) دارد. نقش عمده آن استحکام و انعطاف‌بخشی به غشا سلولها است. کلسترول نوعی چربی و از مواد مهم غشا است. کلسترول در خون هم وجود دارد. کلسترول خون از دو منبع اصلی تامین می‌شود: رژیم غذایی و تولید در کبد. کلسترول رژیم غذایی به طور عمده از گوشت، جگر، مغز، تخم مرغ و غذاهای لبنی به بدن می‌رسد. غذاهایی گیاهی کلسترول ندارند. پس از صرف غذا کلسترول از طریق روده جذب و سپس همراه با تری گلیسیرید ها درون پوششی پروتئینی بسته‌بندی می‌شود. این ترکیب چربی-پروتئین شیلومیکرون نام دارد. کبد هم می‌تواند کلسترول را از خون بردارد و هم آن را تولید و به درون خون بریزد. پس از صرف غذا کبد شیلومیکرون را از خون برداشته و در مدت زمان میان وعده‌های غذایی کلسترول را تولید و درون گردش خون میریزد.

تفاوت ال‌دی‌ال و اچ‌دی‌ال

مقدار زیاد کلسترول ال‌دی‌ال با بیماری‌های کرونری قلب در ارتباط است و به آن «کلسترول بد» گویند. لیپوپروتئین ال‌دی‌ال کلسترول را روی دیواره رگ‌ها نشانده و موجب شکل‌گیری ماده سخت و ضخیمی که همان پلاک کلسترول است می‌شود. با گذشت زمان پلاک کلسترول موجب زخیم‌شدن دیواره رگ و نازک‌شدن مجرای عبور خون می‌شود. این فرآیند تصلب شرائین (آترواسکلروسیس) نامیده می‌شود. چون لیپوپروتئین اچ‌دی‌ال با برداشتن دیواره کلسترول از شریان و بردن آن به کبد از تشکیل پلاک جلوگیری می‌کند، «کلسترول خوب» نامیده می‌شود. بنابراین مقدار ال‌دی‌ال بالا و اچ‌دی‌ال پایین، از فاکتورهای خطر ایجاد تصلب شریان است در حالی که نسبت پایین ال‌دی‌ال به اچ‌دی‌ال برای بدن بسیار سودمند است. هنگامی که ال‌دی‌ال بالا می‌رود کبد نه تنها کلسترول را تولید و به داخل خون میریزد؛ بلکه می‌تواند آن را از گردش خون بردارد. حذف سریع کلسترول ال‌دی‌ال از خون و کاهش آن، با تعداد گیرنده‌های فعال روی سطح سلول‌های کبدی مرتبط است. دو عامل ارث و رژیم غذایی تأثیر چشم‌گیری بر ال‌دی‌ال و اچ‌دی‌ال و کلسترول فرد دارند. برای نمونه هاپیرکلسترولمیای فامیلی اف‌اچ یک اختلال ارثی است که در ان شخص بیمار دچار کمبود و نداشتن گیرنده‌های ال‌دی‌ال روی سطح سلول‌های کبدی می‌شود. در نتیجه افراد مبتلا تمایل بیشتری به پیشرفت تصلب شرائین و بیماریهای ایسکمیک قلبی در سنین بالاتر دارند. رژیم‌های غذایی که دارای مقدار بالای چربی‌های اشباع و کلسترول هستند موجب افزایش مقدار ال‌دی‌ال خون می‌شوند. تری گلیسیریدها براساس ساختمان شیمیایی‌شان به دو گروه اشباع و غیراشباع طبقه‌بندی می‌شوند. چربی‌های اشباع از گوشت و محصولات لبنی تامین می‌شوند و می‌توانند مقدار کلسترول خون را بالا ببرند. همچنین برخی از روغن‌های گیاهی که از نارگیل، نخل و کاکائو تهیه می‌شوند هم چربی اشباع بالایی دارند. ‌  

اگر سطوح کلسترول شما غیر طبیعی است، احتمالاً شما هیچ علامت یا نشانه ای نداشته اید، بنابراین انجام آزمایش کلسترول یک روش مهم برای ارزیابی خطرات بیماری های ذکر شده است. مطالعات بسیاری نشان داده اند که بالا بودن سطوح کلسترول، خود یک ریسک فاکتور مشخص بیماری قلبی است که قاتل شمارۀ یک مردان و زنان است.

چه انواعی از کلسترول اندازه گیری می شوند؟

یک آزمایش کامل کلسترول، شامل اندازه گیری ۴ نوع از چربیها(لیپیدها)ی خون شماست:

• ·  کلسترول کم چگال(LDL). این لیپوپروتئین را گاهی کلسترول ” بد” می نامند. مقادیر زیاد آن در خون منجر به تجمع ذرات چربی (پلاک ها) در شریانهای شما می شود( که به آن آترواسکلروزیس یا تصلب شرایین می گویند) ، که جریان خون را کاهش می دهد. این پلاکها گاهی شریانها را مسدود می کنند و منجر به مشکلات قلبی- عروقی بزرگی می گردند. به علاوه در افراد مبتلا به دیابت و افرادی که احتمال ابتلا به بیماریهای قلبی در آنها بالاست، ذرات کلسترول LDL کوچکتر و فشرده تر می شوند، این ذرات ریز فشرده می توانند باعث صدمات بیشتر به عروق خونی شوند که این مشکلات در افراد کم خطرتر و افرادی که دیابت ندارند، کمتر است.
• ·  کلسترول پرچگال(HDL): گاهی به آن کلسترول “خوب” می گویند، زیرا با بازکردن شریانهای شما به حمل و عبور کلسترول بد(LDL) کمک و جریان خون را تسهیل میکند.
• ·  تری گلیسیریدها. تری گلیسیریها انواع دیگری از چربیهای خون شما هستند. هنگامی که شما غذا می خورید، بدن شما کالری های اضافی را به تری گلیسیرید ها تبدیل می کند که در سلولهای چربی ذخیره می شوند و بعدها برای تولید انرژی آزاد می شوند. سطوح بالای تری گلیسیرید معمولاً نشان دهندۀ آن است که شما به طور مرتب بیش از آنچه می سوزانید، کالری دریافت می کنید. همچنین در افراد چاق و آنان که مقادیر بسیار زیاد شیرینی یا الکل می خورند و در مبتلایان به دیابت که سطح قند خون زیادی دارند، سطوح تری گلیسیرید خون بالاست.
• ·   کلسترول تام. این یعنی مجموع کل مقادیر کلسترول بدن شما.

این چهار نوع چربی همراه هم تعیین کنندۀ احتمال حمله قلبی، سکته یا صدمات عروق خونی (بیماریهای عروقی) هستند. نتایج یک آزمایش کلسترول به صورت مقادیر به دست آمده بر حسب میلی گرم در هر دسی لیتر (mg/dl) ارائه می شود.

اندازه گیری کلسترول تام به تنهایی امکان پذیر است، اگر چه این آزمایش تکی زیاد مورد استفاده قرار نمی گیرد، زیرا دانستن سطح کلسترول تام به تنهایی، به اندازۀ آزمایش های کامل کلسترول به تصمیم گیری پزشک شما کمک نمی کند.

در سال ۲۰۰۱، گروهی از متخصصین به نام متخصصین برنامه طرح آموزشی کلسترول ملی، پیشنهاد کردند که بهترین آزمایش کلسترول، ۴نوع از چربیها در خون شما را که شامل شرح حال لیپیدهاست، اندازه گیری کنند.

چه افرادی باید آزمایش کلسترول انجام دهند؟

همه بزرگسالان ۲۰ سال به بالا باید هر ۵سال یک آزمایش کلسترول انجام دهند. اگر شما دارای سابقه فامیلی بیماریهای قلبی یا کلسترول بالا هستید، چاق هستید، فعالیت بدنی تان کم است، دیابت دارید یا زیاد در رژیم غذایی خود چربی می خورید، انجام آزمایش کلسترول برای شما بسیار مهم است. این فاکتورها شما را در خطر افزایندۀ کلسترول بالا و بیماری قلبی قرار می دهند.

اگر سطوح کلسترول خون شما بالا رفته است، شاید پزشکتان از شما بخواهد که این آزمایشها را با فواصل زمانی کمتری انجام دهید. اگر سطح کلسترول خونتان غیر طبیعی است، دربارۀ اینکه هر چند وقت یکبار باید آزمایش بدهید، با پزشک خود صحبت کنید. این احتمال وجود دارد که پزشکتان از شما بخواهد در هفته های متعدد یا ماهها آزمایش را انجام دهید. قبل از آغاز هر نوع درمان براساس تنها یک آزمایش کلسترول غیر عادی، معمولاً چندین آزمایش در زمانهای مختلف انجام می دهند تا در تشخیص مطمئن شوند.

اگر شما سالم هستید، باید مقادیر کلسترول خود را بدانید یک بیماری حاد، یک حمله قلبی یا استرس های شدید می توانند سطح کلسترول شما را تحت تأثیر قرار دهد. در طول بارداری، اغلب کلسترول بالاست، بنابراین خانم های باردار برای اندازه گیری آن، حداقل باید ۶ هفته بعد از تولد نوزادشان صبر کنند.

شما چگونه برای انجام آزمایش کلسترول آماده می شوید؟

شما باید برای مدت ۹تا۱۲ ساعت قبل از انجام آزمایش غذا نخورده باشید(نه غذا، نه مایعات، به جز آب). شما می توانید آب بخورید، اما از خوردن چای، قهوه و سایر نوشیدنیها خود داری کنید. دربارۀ سایر شرایط خاص با پزشک خود صحبت کنید. برخی داروها مثل قرصهای ضد بارداری، می توانند سطح کلسترول را بالا ببرند. به همین دلیل اگر شما از این داروها می خورید شاید پزشکتان از شما بخواهد که مصرف آنها را قطع کنید.

آزمایش کلسترول چگونه انجام می شود؟

آزمایش کلسترول یک آزمایش خون است. خون از یکی از رگها و معمولاً از رگی از بازوی شما گرفته می شود. قبل از ورود سرسوزن، ناحیه مورد نظر با یک ضد عفونی کننده تمیز می شود و یک باند الاستیک دور بازویتان، بالای همان ناحیه بسته می شود تا جریان خون را به آن منطقه منحصر کند. این عمل باعث می شود که رگ مورد نظر از خون پر شود.

بعد از اینکه سوزن وارد شد، مقدار کمی از خون داخل یک سرنگ یا ویال جمع آوری می شود. باند را باز می کنند تا دوباره جریان خون به حالت اول باز گردد و به ریخته شدن خون به ویال ادامه پیدا کند. زمانی که خون کافی جمع آوری شد، سوزن را خارج می کنند و ناحیه آزمایش (سوراخ شده) با پوششی، پوشانده می شود.

کل مراحل احتمالاً حدود ۲دقیقه به طول می انجامد و دردناک نیست، اگر چه برخی مردم درد متوسطی را زمانی که سوزن وارد بازویشان می شود، احساس می کنید، اغلب مردم تنها یک سوزش سرسوزن را حس می کنند.

نتایج آزمایش کلسترول

نتایج آزمایش کلسترول به صورت میلی گرم در دسی لیتر(mg/dl) خون ارائه می شود. برای تفسیر نتایج آزمایش خود از این راهنمای عمومی استفاده کنید:

کلسترول تام:

کمتر از mg/dl 200 ……………………………. قابل قبول

200 تا mg/dl 239 …………………………….. خط مرزی

Mg/dl 240 و بالاتر از آن……………………….. بالا

کلسترول LDL:

کمتر از mg/dl 70 ……… بهترین برای افرادی که مبتلا به بیماری قلبی بوده یا بسیار در خطر این بیماری هستند.

کمتر از mg/dl 100 …….. بهترین برای افرادی که در خطر بیماری قلبی هستند.

100 تا   mg/dl129………. نزدیک بهینه

130 تا mg/dl 159 ………. خط مرزی

160 تا mg/dl189 ………… بالا

mg/dl 190 و بالاتر از آن ………… بسیار بالا

کلسترول HDL:

کمتر از mg/dl 40…………….. کم

40 تا mg/dl 59 ………………. بهتر

mg/dl 60 و بالاتر از آن………. بهترین

تری کلیسیرید:

کمتر از  mg/dl 150 …………. قابل قبول

150 تا mg/dl 199 ………… خط مرزی

200 تا mg/dl499 …………. بالا

mg/dl 500 و بالاتر از آن ……….. بسیار بالا

Lp(a) ، پروتئین واکنشی-C (C- reactive protein) و سایر موارد

این ۴ دسته اصلی لیپیدها- کلسترول تام، کلسترول LDL، کلسترول HDL و تری گلیسیرید- رایج ترین چیزهایی هستند که در طول آزمایش کلسترول، اندازه گیری می شوند. ارزش دانستن این اندازه گیریها برای تخمین احتمال خطر بیماری قبلی توسط مطالعات پزشکی به اثبات رسیده است. اگر چه این حقیقت دارد که حدود نیمی از مردم که دچار حمله قلبی می شوند یا سکته می کنند، هر ساله سطوح کلسترول طبیعی دارند. بنابراین بسیاری از پزشکان، آزمایش سایر مواد موجود در خون را آغاز کرده اند. آنها امیدوارند که دانستن سطوح برخی از این مواد بتواند آنها را در پیشگویی بهتر آنکه چه کسانی در خطر بیماری قلبی هستند، یاری دهد. آزمایشهای این ماد در خون اغلب بر روی همان نمونه خونی گرفته شده در طول آزمایش کلسترول، انجام می شود و نشانگر کامل بودن یک آزمایش پروفایل چربی است. مدارک نشان دهندۀ آن است که این آزمایشهای اضافی چقدر ارزش دارند. در اینجا برخی آزمایشهای اضافی که ممکن است پزشک شما همراه با آزمایش استاندارد کلسترول تجویز کند، آورده می شود:

• ·  لیپوپروتئین(a) و یا LP(a). از آنجایی که این لیپو پروتئین یک ریسک فاکتور آترواسکلروزیس (تصلب شرایین) است، خیلی زیاد مورد آزمایش قرار می گیرد.  LP(a)
• ·  آپو لیپوپروتئین (apo A-1) A-1. A-1  پروتئینی است که به کلسترول HDL شما در پاکسازی کلسترول LDL از بدن کمک می کند. آزمایش این پروتئین رایج نیست، اما می تواند توسط پزشک شما، در صورتیکه سابقه فامیلی بیماری قلبی دارید یا کلسترول خونتان بالاست، دستور داده شود. اگر سطح apo A-1خیلی پایین باشد، می تواند نشانه ای برای این باشد که شما در یک خطر افزایندۀ بیماری قلبی هستید.
• ·  آپو پروتئینB (apo B). Apo B پروتئینی است که قسمتی از هر ذرۀ کلسترول LDL است. دانستن سطوح Apo B معمولاً نشانه خوبی از سطح کلسترول شما به پزشکتان ارائه می دهد. برخی تحقیقات پیشنهاد می دهند که ممکن است Apo B یک پیشگوی ریسک بیماری قلبی باشد. این پروتئینی به صورت معمول اندازه گیری نمی شود، اما در صورتیکه پزشکتان به بیماری قلبی شما مظنون باشد یا شما دارای سابقه بیماری قلبی با کلسترول خون بالا باشید، مورد استفاده قرار می گیرد.
• ·  پروتیئن High – sensitivity c-reactive. پروتئین (hs-CRP) HS-C-reactive پروتئینی است که کبد شما به عنوان قسمتی از پاسخ سیستم ایمنی شما به عفونت یاجراحت می سازد. این پروتئین توسط سلولهای ماهیچه ای شریانهای کرونری ساخته می شود. سطوح بالای hs-CRP در خون شما ممکن است همراه با یک افزایش خطر حمله قلبی، سکته و مرگ قلبی ناگهانی باشد. برخی پژوهشگران با اینکه hs-CRP نسبت به کلسترول برای پیشگویی بیماری قلبی بهتر است، مخالف هستند. گرچه مدارک تایید کنندۀ hs-CRP در حال افزایش هستند، جامعه قلب آمریکا هنوز غربالگری hs-CRP را برای جامعه عمومی توصیه نمی کند(تنها به افرادی توصیه می کند که خطر بیماری قلبی آنان افزایش یافته است).
• ·  هموسیستئین (Homocysteine). هموسیستئین یک اسید آمینه در بدن شماست که برای ساخت پروتئین (ساختمان و استحکام) بافت مورد استفاده قرار می گیرد. اما مقادیر بیش از اندازه آن در خون شما ممکن است خطر سکته و انواع خاصی از بیماریهای قلبی و بیماری عروق خونی بازوها، پاها(بیماری های عروق محیطی) را افزایش دهد. ممکن است در صورتیکه مشکلات قلبی – عروقی داشته باشید، اما هیچ یک از ریسک فاکتورهای سنتی مثل سیگار کشیدن را نداشته باشید، پزشکتان سطح هموسیستئین شما را چک کند.

یکی از انواع LDL است. سطح LP(a) شما توسط ژنها تعیین می شود و به طور کلی تحت تاثیر نحوه زندگی نیست. برخی پژوهشها کلسترول نشان داده اند که سطوح بالای LP(a) ممکن است باعث افزایش احتمال بیماری قلبی شود، گر چه هنوز مشخص نیست چقدر میزان این خطر را بالا می برد. در صورتیکه شما مبتلا به بیماری قلبی باشید اما سطوح کلسترول شما به نظر طبیعی برسد، ممکن است پزشک به شما دستور یک آزمایش LP(a) را بدهد.معمولاً اگر شما سابقه فامیلی بیماری قلبی ای مرگ ناگهانی داشته باشید، همچنین اگر کلسترول LDL شمابه درمانهای دارویی به خوبی جواب ندهد، LP(a) مورد آزمایش قرار می گیرد.

ممکن است هموسیستئین در تخمین احتمال بیماریهای عروق محیطی هم مفید باشد.

تکنولوژی جدید آزمایش کلسترول

یک نوع جدید از آزمایش کلسترول در حال فن آوری است که اندازه و تعداد ذرات کلسترول LDL و HDL شما را اندازه گیری می کند.

این روش آزمایش از یک اسپکتروسکوپی NMR (رزونانس مغناطیسی هسته ای). به نظر می رسد که دانستن اندازه و مقدار هر یک از انواع ذرات کلسترول LDL و HDL خون شما می تواند یک پیشگوی احتمال بیماری قلبی باشد. تحقیقات بر روش NMR و مؤثر بودن آن در حال انجام است.

روش انجام آزمایش:

۳ لوله آزمایش آماده می کنیم در لوله اول ۰/۱ میلی لیتر آب مقطر در لوله دوم ۰/۱ میلی لیتر استاندارد کلسترول و در لوله سوم ۰/۱ میلی لیتر نمونه سرم می ریزیم.سپس به هر کدام از لوله ها ۲/۵ میلی لیتر معرف رنگ زا اضافه می کنیم.محتویات درون هر یک از لوله ها را خوب مخلوط می کنیم به مدت ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار می دهیم سپس به هر کدام از لوله ها ۰/۵ میلی لیتر اسید سولفوریک غلیظ اضافه می کنیم و خوب مخلوط می کنیم.لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه در یک بشر آب می گذاریم سپس OD آنها را در ۵۸۰nm می خوانیم.

تهیه استانیلید آمین

ایزومریزاسیون “انواع ایزومرها”

دو ترکیب که فرمول مولکولی یکسان ولی آرایش اتمی متفاوت داشته باشد ایزومر نامیده می‌شوند. به عبارتی ترکیباتی که دارای فرمولهای بسته مشابه ولی فرمولهای گسترده متفاوت باشند را ایزومری می‌گویند. چنین ترکیباتی در خواص شیمیایی و فیزیکی باهم فرق دارند. این کلمه از واژه یونانی isos به اضافه meros به معنای (ساخته شده از بخش‌های یکسان ) گرفته شده است.

ریشه لغوی

واژه ایزومری اولین بار به توسط برزلیوس (J.J.Berzelius) برای معرفی ترکیبات شیمیایی گوناگون دارای ترکیب درصد عناصر یکسان ، به عبارت دیگر تناسبهای نسبی یکسان عناصر سازنده ، مورد استفاده واقع شد. این احتمال که یکسانی ترکیب درصد عناصر سازنده بتواند دلالت بر وجود دو یا چند ماده به عنوان ایزومرهای یکدیگر نماید، از تئوری ساختمانهای آلی مشتق شده است. در حالت کلی ، می‌توان ایزومرها را به دو نوع ایزومری ساختمانی و ایزومری فضایی تقسیم‌ بندی نمود. که هر کدام از این ایزومرها دارای انواع مختلف می‌باشند.

ایزومری ساختمانی

ایزومری ساختمانی بوسیله ترکیباتی که در فضای کوئوردیناسیون خود لیگاندهای متفاوتی دارند نمایش داده می‌شود. و انوع زیرا را در بر می‌گیرد:

ایزومری یونش

در این نوع ایزومری ، یون یا یونهایی که در یک ایزومر در کره کوئوردیناسیون خارجی قرار دارند، در ایزومر دیگر در نقش لیگاند در کره کوئوردیناسیون داخلی وارد می‌شود و در ترکیبهایی که آنیون در ساختار داخلی و خارجی کره کوئوردیناسیون شرکت دارد مشاهده می‌شود.

ایزومری هیدراته شدن

مولکول آب در ترکیب کوئوردیناسیون ممکن است مستقیما با فلز پیوند داشته باشد یا در کره کوئوردیناسیون خارجی به عنوان آب تبلور شرکت کند. ترکیبهایی که بر اساس این تفاوت دسته بندی می‌شوند، ایزومرهای هیدرات (هیدراتاسیون) نامیده می‌شوند و دارای خواص فیزیکی و شیمیایی متفاوتی هستند.

ایزومری کوئوردیناسیون

در ترکیبات یونی که هم کاتیون و هم آنیون آنها کمپلکس مشاهده می‌شود و تفاوت آنها در توزیع لیگاندها اطراف اتمهای مرکزی است. این دو ایزومر در اثر تعویض لیگاندها اتم مرکزی بوجود می‌آید. Cu(NH₃)₄ PtCl₄ ↔ Pt(NH₃)₄ CuCl₄ ↔ Pt(NH₃)₃Cl Cu(NH₃)Cl₃

ایزومری اتصال

این ایزومرها به خانواده‌های متفاوتی از ترکیبات آلی مربوط می‌شوند که تنها فرمولهای مولکولی مشابه دارند. بطور مثال الکل و اتر با هم ایزومر گروه عاملی هستند. در ترکیبهایی دیده می‌شود که یک یا چند لیگاند دارای دو اتم کوئوردیناسیون دهنده باشند، برای مثال یون نیتریک NO^-₂ می‌تواند از طریق یک اتم اکسیژن یا از طریق اتم نیتروژن کوئوردیناسیون بدهد. زرد NH₃)₅CO(NO₂)) Cl₂)) و قرمز NH₃)₅-CO-ONO) Cl₂))

ایزومری فضایی

شامل ایزومری هندسی و نوری می‌باشد.

ایزومری هندسی

ترکیبات وقتی ایزومرهای فضایی یکدیگرند که در فضای کوئوردیناسیون خود لیگاندها یا گروههای یکسان داشته باشند ولی نحوه آرایش آنها در فضا متفاوت باشد. یک نوع این ایزومر فضایی ، ایزومری هندسی ، یا ایزومری سیس- ترانس ، است. در آلکنها ، وقتی گروههای مشابه در یک طرف پیوند دوگانه باشند، ایزومر سیس و اگر در دو طرف پیوند دوگانه باشند، ایزومر ترانس است. اگر دو گروه مشابه به یک کربن آلکن متصل باشد، ایزومری سیس و ترانس وجود ندارد. اما اگر گروههای مختلف به کربنهای پیوند دوگانه متصل باشند، ایزومری هندسی دیده‌ می‌شود. اگر در آلکنها ، فقط یک اتم هیدروژن و سه عامل جانشینی دیگر داشته باشیم، بجای سیس و ترانس از سیستم Z و E استفاده می‌کنیم. روی کربن متصل به پیوند دوگانه دو گروه وجود دارد یکی از این دو گروه بر دیگری ارجحیت دارد. آن گروه را مشخص می‌کنیم. مشخص کردن آنها به عدد اتمی عنصر متصل به کربن بستگی دارد که هر چه بیشتر باشد، ارجحیت بیشتری دارد. در مورد ترکیبات کوئوردیناسیون ، این نوع ایزومری در اثر اشغال موقعیت‌های مختلف در اطراف اتم مرکزی توسط لیگاند بوجود می‌آید و در گونه‌های مسطح مربعی و هشت وجهی اهمیت بیشتری دارد. برای مثال در ایزومر سیس- دی کلرو دی آمین پلاتین (II) اتم‌های کلر روی گوشه‌های مجاور مربع (در امتداد یک ضلع) واقع شده‌اند، در حالیکه در ایزومر ترانس ، اتمهای کلر گوشه‌های مقابل دور امتداد را اشغال می‌کنند. مثلا برای ترکیب  دو فرمول گسترده فضایی می‌توان نوشت:

ایزومری نوری

نوع دیگری ایزومر فضایی ، ایزومری نوری است. پاره‌ای از مولکولها و یونها در دو شکل که قابل انطباق بر یکدیگر نیستند، رابطه بین آنها مثل رابطه دستهای راست و چپ است وجود دارند و از چنین مولکولها و یونهایی به عنوان نامتقارن یاد می‌شود و این ایزمرها را انانتیومر (تصویر آینه‌ای) می‌نامند. این ایزومرها دارای خواص فیزیکی یکسان می‌باشند و تنها تفاوت ایزومرهای نوری تاثیر بر نور قطبی شده است. این نوع ایزومری در مولکولهای کایرال وجود دارد. اگر دو ترکیب از هر لحاظ با هم مشابه باشند بر یکدیگر منطبق می‌شوند در حالیکه یک مولکول کایرال ممکن است دارای یک ایزومر فضایی باشد که بر تصویر آینه‌اش منطبق نیست (انانتیومر). تفاوت چنین ایزومرهایی مانند اختلاف دست چپ و راست است. ایزومر راست گردان (d) نور قطبی شده (نوری که در یک صفحه نوسان می‌کند) را به راست و ایزومر چپ گردان (L) آن به چپ می‌چرخاند. مخلوط مساوی از دو ایزومر را اسمیک می‌نامند، اثری بر نور قطبی شده ندارد. شرح آزمایش در یک بالون تقطیر ۵ گرم مالئیک اسید ریخته و به آن ۵ میلی لیتر آب اضافه کرده  هم میزنیم تا حل شود سپس ۱۰ میلی لیتر HCL غلیظ به آن اضافه کرده و با افزودن چند عدد سنگ جوش سیستم رفلاکس را سوار میکنیم و ۳۰ دقیقه رفلاکس می کنیم سپس حرارت را قطع نموه بعد از خشک شدن محتویات بالون را به بشر انتقال داده و رسوب حاصل را صاف می کنیم.پس از خشک شدن رسوب راندمان را محاسبه می کنیم