کرم روده یا آسکاریس

کرم معمولی روده انسان و خوک یا آسکاریس لومبریکوئیدس یکی از نمونه بارز رده لوله سانان یا کرمهای لوله‌ای است. لوله سانان در میان جانواران پر یاخته از حیث تعداد ، بعد از حشرات شاید مقام دوم را داشته باشند. بسیاری از آنها در آب یا خاک بطور آزاد زندگی می‌کنند و بسیاری دیگر نیز در بافتها یا مایعات جانوران و گیاهان به حالت انگل به سر می‌برند.

ساختمان کرم روده

طول کرم ماده ۲۰ تا ۴۰ سانتیمتر است و حداکثر قطر آن در حدود ۶٫۵ میلیمتر است. اندازه نر کوچکتر و طول آن از ۱۵ تا ۵ سانتیمتر است. نمونه‌های تازه به رنگ زرد تا میخکی است. بدن حیوان لوله‌ای و باریک است و در هر دو انتها نازک می‌شود. پوشش بدن از کوتیکول صاف است که دارای خطوط کوچک می‌باشد. چهار خط طولی سفید رنگ در طول بدن امتداد می‌یابد. دهان در انتهای قدامی میان سه لب مدور باز می‌شود.

مخرج عبارت از یک شکاف عرضی است که نزدیک انتهای خلفی در سطح شکمی قرار دارد. انتهای خلفی کرم نر کاملا خمیده بوده و دارای دو سیخک تناسلی می‌باشد که از سوراخ تناسلی نر واقع در داخل مخرج بیرون می‌آید. کرم ماده راست تر بوده و منفذ تناسلی آن در وسط سطح شکمی و در فاصله ۱٫۳ از انتهای قدامی بدنش واقع است.

لوله گوارش

لوله گوارش جانور راست بوده و در طول بدن کشیده می‌شود. این لوله دارای قسمتهای زیر است.

دهان

یک حفره دهانی

حلق عضلانی یا مری به درازای تقریبا ۱۳ میلیمتر که عمل آن مکیدن و کشیدن غذا است.

یک روده باریک و دراز که غیر عضلانی است و از لایه‌ای مرکب از سلولهای آندودرمی بلند که غذای گوارش یافته را جذب می‌کند، تشکیل و از خارج بوسیله کوتیکولی پوشیده شده است.

یک روده راست کوتاه که مواد زاید را از مخرج تخلیه می‌کند.

سایر دستگاهها

اندامهای گردش خون و دم‌زدن در حیوان وجود ندارد. قسمت داخلی هر خط جانبی دارای یک مجرای وازنشی (دفعی) است. هر دو مجرای وازنشی از سوراخ کوچکی واقع در پشت دهان و در وسط سطح شکمی به خارج تخلیه می‌شود. یک حلقه عصبی اطراف مری را احاطه می‌کند. این حلقه عصبی به ۶ عصب قدامی کوتاه و ۶ طناب عصبی خافی متصل می‌گردد. یک طناب عصبی بزرگتر پشتی و یکی هم شکمی در امتداد خط طولی بدن قرار دارد. برآمدگیهای مختلف که در سطح بدن وجود دارد، احتمالا عمل حسی را انجام می‌دهد.

دستگاه تولید مثل

هر اندام تولید مثل عبارت از لوله باریکی است که انتهای داخلی آن مسدود بوده و قطر آن تدریجا زیاد می‌شود. غدد تناسلی و مجرای تولید مثل به هم متصل و ممتد می‌باشد. دستگاه تولید مثل نر شامل بیضه ، مجرای ناقل اسپرمی ، کیسه اسپرمی ، مجرای انزالی و کیسه محتوی دو سیخک تناسلی است. دستگاه تولید مثل ماده شامل ۲ تخمدان ، یک اویدکت یا لوله تخمی و یک رحم است.

دو شاخه رحم هم در یک مهبل کوتاه به هم متصل می‌شود. مهبل به منفذ تناسلی ماده باز می‌گردد. کرمهای نر و ماده در داخل روده میزبان جفت گیری می‌کنند. یک ماده بزرگ می‌تواند یکباره حاوی ۲۷۰۰۰۰۰۰ (بیست و هفت میلیون) تخم باشد و روزانه دویست هزار یا بیشتر تخم بگذارد. تخمها از حیوان ماده خارج شده و به داخل روده میزبان می‌ریزد و همراه با مدفوع بیرون می‌ریزد.

وضع طبیعی

کرم روده یا آسکاریس انگلی است که در روده میزبانش زندگی می‌کند و به همین جهت تعیین اعمال مختلف زیستی یک انگل داخلی هنگامی که در مسکن طبیعی خود به سر می‌برد، کار مشکلی است. لذا احتمال دارد که استنباطات زیر درست باشد.

کوتیکول کرم زنده را در برابر شیره‌های گوارشی میزبان حفظ می‌کند.

غذا از مواد نیمه مایع روده میزبان بدست می‌آید و بوسیله مری عضلانی کرم به داخل کشیده می‌شود. پس از گوارش از دیواره روده عبور کرده به توسط مایع موجود در فضای بدنی در بافتهای دیگر توزیع و تقسیم می‌گردد.

تنفس به شکستن یا تجزیه شدن گلیکوژن در داخل بدن کرم بستگی دارد. زیرا اکسیژن آزاد محتویات روده میزبان بسیار کم است.

سیر تکاملی

قبل از آن که تخمها بتوانند میزبان دیگری را آلوده کنند، لازم است از نظر سیر تکاملی مرحله‌ای را بگذراند. همچنین تخمهای مزبور در شرایط نامساعد مثلا سرما می‌توانند ماههای بسیاری در حال بی حرکتی و خواب باقی ماند. سیر تکاملی در جای گرم ، مرطوب و سایه دار به ۲ یا ۳ هفته وقت احتیاج دارد. اگر این تخمهای جنین دار (حاوی کرمهای جنینی) بوسیله میزبان مناسبی ، ضمن غذا یا آب خورده شود، به طرف معده حرکت می‌کند و در آنجا لاروها از تخم بیرون می‌آیند و به داخل سیاهرگها یا عروق لنفی دیواره روده نفوذ می‌نمایند.

سپس به طرف کبد و قلب و مویرگهای ریوی به گردش در می‌آیند و ضمنا از لحاظ اندازه نیز بزرگ می‌شوند. ظرف چند روز لاروها به داخل راهها یا گذرگاههای هوایی آمده از نای ، مری و معده مجددا به طرف روده حرکت می‌کنند. در روده به صورت کرم رسیده و بالغ در می‌آیند. برای تکمیل و اتمام دوره زندگی کرم روده میزبان واسطه لازم نیست.

میزبان کرم آسکاریس

میزبان این کرم انسان و خوک می‌باشد. کرمهایی که در انسان و خوک وجود دارند، از نظر ساختمانی به هم شبیه‌اند، ولی از نظر فیزیولوژیکی اختلاف دارند. بدین ترتیب که تخمهای آلوده کننده کرم روده انسانی (کرم روده اطفال) معمولا در خوکها تولید کرم نمی‌کنند و بر عکس خوکهای جوان (بچه خوک ) معمولا لاروها را از خاکهای آلوده در طویله یا از پستان کثیف ماده خوک در موقع شیر خوردن می‌گیرند. خوکهای بالغ در برابر آلودگی نسبتا مصون هستند.

آلودگی انسان به کرم روده امر شایع و رایج است و اکثر مردم نواحی روستایی مبتلا هستند. کرمها ممکن است ترشحات سمی در روده تولید کنند یا به علت کثرت تعداد کرمها در روده ، مانع و انسداد بوجود آید. گاهی اوقات کرمها به طرف دهان یا بینی مهاجرت می‌کنند و حتی دیواره روده را به منظور رسیدن به سایر اندامها سوراخ می‌کنند. از این رو کسالت وخیم و یا مرگ را برای میزبان به بار می‌آورند.

عوارض آسکاریدوز

وجود تعداد زیاد کرم آسکاریس ،‌ مهاجرت و یا تجمع آنها در روده‌ها گاهی سبب ایجاد عوارض شدید می‌شود. این عوارض عبارتند از انسداد روده‌ها ، ابتلای کیسه صفرا ، پانکراتیت و آپاندیست حاد و سوراخ شدن روده‌ها. علایم انسداد روده ها شامل درد ناگهانی و پیچش شکم همراه با استفراغ ، اتساع شکم و مشاهده انسداد در عکس‌برداری با اشعه ایکس است.

تشخیص

تشخیص آلودگی به کرم بالغ با آزمایش مدفوع و مشاهده تخم به آسانی صورت می‌گیرد . در این مرحله تشخیص انسداد روده به علت آسکاریس با لمس شکم و توده‌های نرم و متحرک در زیر انگشتان ممکن است. تشخیص استقرار کرم آسکاریس در محلهای دیگر بدن فقط در هنگام عمل جراحی امکان دارد. بهترین روش آزمایش مدفوع برای تشخیص آسکاریس استفاده از روش کاتوکاتز است.

درمان

چند داروی موثر بر آسکاریس عبارتند از: ترکیب مبندازول ، ترکیب لوامیزول و ترکیبات پیرانتل پاموت.

رنگ آمیزی سلول های پوششی دهان

تئوری :

یکی از اصول و روش های مطالعه سلول های گیاهی و جانوری استفاده از متد رنگ آمیزی است.بااستفاده از رنگ های مختلف زیستی می توانیم اجزا و ارگانرهای مختلف سلول را رنگ آمیزی کنیم.

اساس و پایه رنگ آمیزی ترکیب مولکول های ماده رنگی مورد نظر با مولکول های اندام یا اجزای هدف می باشد.تعدادی از مواد رنگی به صورت رنگ عمومی کاربرد دارد و برخی از رنگ ها مثل سبز ژانوس رنگ اختصاصی میتوکندری و یا قرمز خنثی برای رنگ آمیزی واکوئل است.رنگ های زیستی به رنگ هایی اطلاق می شود که هیچ گونه اثر سوئی در سلول های زنده نداشته باشد.

یک تعداد از رنگ های مورد استفاده رنگ های اسیدی و یک عده دیگر جز رنگ های بازی است که این مواد هم با قسمت های آنیونی و کاتیونی غشای اندامک ها ترکیب می شوند و موجب رنگی شدن آن دیواره ها می شوند.

باشد.تعدادی از مواد رنگی به صورت رنگ عمومی کاربرد دارد و برخی از رنگ ها مثل سبز ژانوس رنگ اختصاصی میتوکندری و یا قرمز خنثی برای رنگ آمیزی واکوئل است.رنگ های زیستی به رنگ هایی اطلاق می شود که هیچ گونه اثر سوئی در سلول های زنده نداشته باشد.

یک تعداد از رنگ های مورد استفاده رنگ های اسیدی و یک عده دیگر جز رنگ های بازی است که این مواد هم با قسمت های آنیونی و کاتیونی غشای اندامک ها ترکیب می شوند و موجب رنگی شدن آن دیواره ها می شوند.

اجزای مختلف یاخته زنده به علت دارا بودن اختلاف غلظت و ضریب شکست بسیار کم به هنگام جذب طیف نور مرئی ، به قدر کافی کنتراست یا اختلاف میزان نور از خودشان نمی‌دهند. رنگهای زیستی ، بدون اینکه اندامکهای یاخته را بی‌جان سازند، آنها را بطور انتخابی رنگ‌آمیزی می‌کنند.

روش انجام آزمایش :

ابتدا لام ها را از قسمت پهنش از طرف داخل به گونه کشیده تا کمی از سلول های پوشاننده ی دهان را بر دارد سپس یک قطره آب روی لام میگذاریم و آن را آرام به روی قسمت خیس لام میکشیم تا سلول های جدا شده ی گونه به روی آن منتقل شود.

سپس چند قطره از رنگ های زیستی را با آب مقطر رقیق کرده به گوشه ی نمونه اضافه می کنیم تا کم کم در سطح نمونه پخش شود بعد یک لامل برداشته و آن را روی نمونه می گذاریم. حال می توانیم سلول های رنگ شده ی گونه را با عدسی ۴۰ مشاهده کنیم.

تعیین طول عرض و ضخامت سلول

تئوری :

پر سلولی دارای ۳بعد طول عرض و ضخامت یا عمق است.در بررسی ابعاد سلولی از از ۲ روش کلی دستی و دستگاهی استفاده می شود.

در روش دستی می توان یا از اکولارگراتیکول بهمراه لام خاص آن استفاده کرد و یا از سیستم درجه بندی خود میکروسکوپ بهره گرفت . در روش دستی و دقیق اکولار لنزی است که قسمت میانی آن مدرج است . در روش دستی تقریبی از سیستم درجه بندی خود میکروسکوپ بهمراه سلول های بشره پیاز استفاده می شود.

روش دستی تقریبی(با استفاده از سیستم ورنیه خود میکروسکوپ)بیشتر در مورد بررسی سلول های گیاهی بکار می رود.

روش دستی دقیق(لام میکرومتری و اکولارگراتیکول)بیشتر در بررسی باکتری ها بکار می رود.

ابعاد سلولی

اکثر سلولها میکروسکوپی بوده و با چشم غیر مسلح دیده نمی‌شوند. سلولهای شاخص حیوانی و گیاهی ، دارای قطری حدود ۵ – ۱۰۰ میکرومتر بوده ( ^۶-۱۰ متر) و بسیاری از باکتریهای تنها ۱ – ۲ میکرومتر طول دارند. چه چیزی ابعاد سلولی را محدود می‌نماید؟ به حداقل اندازه سلول احتمالا حداقل تعداد هر نوع بیومولکول مورد نیاز سلول ، تعیین می‌گردد.

• کوچکترین سلولها ، باکتریهای خاصی به نام مایکوپلاسماها ، دارای قطری حدود ۳۰۰ نانومتر (^۹-۱۰ متر) و حجمی در حد ^۱۴-۱۰ میلی لیتر می‌باشند. بلند ترین بعد یک ریبوزوم باکتریایی حدود ۲۰ نانومتر بوده و بنابراین چند ریبوزوم موجود در سلول مایکوپلاسمایی ، کسر مهمی از حجم سلول را شامل می‌گردد. سلولی با این اندازه ، تنها شامل ۶۰۰۰ مولکول از متبولیتها می‌باشد.
• حد بالای اندازه سلول احتمالا توسط میزان انتشار مولکولهای حل شده در سیستمهای آبی ، تنظیم می‌گردد. یک سلول باکتری که برای تولید انرژی وابسته به واکنشهای مصرف اکسیژن می‌باشد (سلول هوازی) می‌بایست اکسیژن مولکولی را از محیط اطراف ، از طریق انتشار و از میان غشای پلاسمایی خود به دست آورد. این سلول بسیار کوچک بوده و نسبت سطح به حجم آنقدر بزرگی دارد که اکسیژن انتشار یافته به داخل سلول ، براحتی به هر قسمتی از سیتوپلاسم آن می‌رسد.
• از بزرگترین سلولها می‌توان سلولهای ماهیچه‌های اسکلتی پستانداران (در حدود ۱۲ سانتیمتر) و سلولهای عصبی (که در برخی از حیوانات بیش از یک متر طول دارد) را نام برد. قطر گلبول قرمز انسان در حدود ۷ میکرون و اندازه سلول تخم انسان در حدود ۰٫۲ میلیمتر است و با چشم غیر مسلح قابل روئیت می‌باشد. حال آنکه اسپرماتوزئید طولی در حدود ۵۷ میکرون دارد. بطور کلی اندازه سلولها تابع تنوع پذیری موجودات زنده بوده ، ولی برای هر موجود زنده و سلول معینی کاملا ثابت بوده و ارتباط بین سطح غشا و حجم سلول و همچنین ارتبلط بین حجم هسته و حجم سلول ، تعیین کننده این اندازه می‌باشد.

روش انجام آزمایش :

۱تکه از بشره پیاز را با دقت (بدون چروکیدگی و بدون ایجاد حباب)روی لام قرار می دهیم و رنگ لوگل یا استواورسئین اضافه کرده سپس با دقت لامل را قرار می دهیم. پس از چند دقیقه با عدسی شیئی ۱۰ برای طول و عرض و با عدسی شیئی ۴۰ برای محاسبه عمق استفاده می کنیم . سپس با افزودن آب مقطر به همین نمونه و اندازه گیری طول و عرض و عمق نتایج را در دو حالت رنگ آمیزی و بدون رنگ آمیزی با هم مقایسه می کنیم.

ابتدا یک سلول را روی ساعت۱۲ میدان دید قرار داده شاخص عددی ورنیه را با عدسی ۱۰ می خوانیم سپس سلول را در راستای قطب حرکت می دهیم تا به ساعت ۶ میدان دید برسد در همین زمان تعداد سلول ها را نیز می شمریم و عدد ورنیه میکروسکوپ را نیز یادداشت می کنیم.

۱۰۰۰  (عدد در ساعت ۶)-(عدد در ساعت ۱۲)  عرض سلول

برای محاسبه طول سلول نیز به همین نحو نیز عمل می کنیم اما از ساعت ۹ به ساعت ۳ تعداد سلول ها شمارش می شود و درجه دیگر سیستم ورنیه میکروسکوپ در روی صفحه نمونه استفاده می شود(از همان عدسی ۱۰ استفاده می شود.)

اما برای محاسبه ی عمق یا ضخامت سلول از پیچ های ماکرو و میکرو و درجه بندی روی آن ها استفاده می شود و از عدسی شیئی ۴۰ استفاده می شود.

در ابتدا با استفاده از پیچ میکرو هسته ی یک سلول را واضح می کنیم  و عدد شاخص روی پیچ ها را یادداشت می کنیم سپس با تغییر پیچ میکرو سعی می کنیم دیواره همان سلول را به طور واضح مشاهده می کنیم و عدد شاخص را مجددا یادداشت می کنیم. اختلاف بین این دو عدد معرف ضخامت سلول است.

رنگ آمیزی اسپور به روش فولتون و شیفر

مقدمه :

اسپور

اسپور درباکتری ها یک فرم مقاوم است و فرم زایشی نیست ،  و این برخلاف کپک ها و مخمرهای قارچی است . از هرباکتری فقط یک اسپور به وجود می آید و از هر اسپور نیز یک باکتری به وجود می آید.

اسپورها فقط در باکتری هایی تولید می شوند که ژن های مخصوص اسپور زایی داشته باشند. اسپور زایی یک وجه تشخیص و افتراق برای باکتری است . در فرایند اسپور زایی ۲۰۰ ژن دخالت دارند. باکتری ها در زمان احساس خطر اگر ژن اسپورزایی داشته باشند خود را به اسپور تبدیل می کنند.

منظور از عوامل نامساعد محیطی عواملی چون : حرارت ، رطوبت ، تشعشعات مثل نور فرا بنفش و PH است.

درزمان شرایط نامساعد محیطی حدود ۲۰۰ ژن گفته شده یکی یکی شروع به فعال شدن می کنند و سیتوپلاسم خشک می شود. همزمان با این اتفاق DNA  سلول همانند سازی می کند. قسمتی از DNA که همانند سازی شده از قسمت اصلی جدا می شود.

مواد سیتو پلاسمی متراکم شده و در اطراف یکی از کپی های باکتری جمع می شوند. قسمتی از سیتوپلاسم متراکم شده و اطراف آن غشا و دیواره تشکیل می شود که ترکیباتی چون D.P کولینات کلسیم ( سیمان غشا اسپور) در آن وجود دارد. دیواره اسپور به مرور زمان ضخامتش زیاد شده و در قسمتی از سلول جایگزین می شود. در این حالت باکتری به خواب می رود.

میزان سوخت و ساز اسپور کمترین مقدار ممکن است. به اسپوری که به ای حالت تولید شده آندواسپور می گویند و  به اسپوری که از باکتری خارج می شود اگزو اسپور می گویند. موقعیت قرار گیری اسپوردر داخل باکتری متفاوت است ، به طوری که:

۱-   اگر دروسط سلول تشکیل شود central

2-   اگر اسپور در یکی از دو انتهای باکتری تشکیل شود terminal

3-   اگر اسپور مابین انتها و وسط سلول تشکیل شود sub terminal

اسپور از نظر شکلی به دو شکل گرد و یا بیضوی است. قطر اسپور می تواند از قطر باکتری بزرگتر باشد که آن را Bulbing می گویند( باکتری باد کرده).

باکتری هایی که اکثرا اسپور تولید می کنند مربوط به خانواده با سیلاسه هستند.

۱-   باسیلوس

۲-   کلستریدیوم

همگی این خانواده به صورت میله ایند. در کوکسی ها هم برخی اسپور تولید می کنند که به آنها اسپوروسالسینا می گویند.

عمل تبدیل اسپور به فرم فعال را جوانه زدن می گویند ( germination )

اجزا اسپور عبارتند از:

۱) core ( قسمت مرکزی ) : حاوی سیتوپلاسم متراکم، DNA ، ریبوزوم ، RNA ، آنزیم های که همیشه کاربرد دارند.

۲) لایه ای به نام core wall ( دیواره اسپور) : شامل دو قسمت دیواره سلولی و غشاسیتوپلاسمی است.

۳) لایه ای به نام  cortex.

4) لایه ای به نام spore coat  ( پوشش های اسپور): بیشتر از یک لایه است.

۵) قسمت بیرونی به نام Exosporium .

برای رنگ آمیزی اسپورها  ۳ روش وجود دارد:

۱-                                                              wirty Conklin

2-                                                              schaeffer – falton

3-                                                              dorner

مالاشیت گرین ……………………………………………………………………………………………………….

از مالاشیت گرین در صنعت به عنوان دارویی برای مقابله با انگل ها و قارچ های آبی استفاده می شود. این ماده به طور معمول در مراکز تولید مصنوعی ماهی کپور معمولی ( Cyprinus carpio ) به عنوان داروی ضد قارچ استفاده می شود ، اما این دارو به عنوان عامل بروز ناهنجاری ، ماده ای جهش زا ، عامل پیش سرطان ، آلوده کننده ی محیط های آبی شناخته و مصرف آن ممنوع گردید ، اگر چه همچنان در بسیاری از مراکز تکثیر و پرورش آبزیان در ایران از این ماده استفاده می شود. از جمله موادی که می توان به جای مالاشیت گرین استفاده کرد ، پراکسید هیدروژن ( H₂O₂ ) است. آژانس دارو و غذای آمریکا (FDA ) پراکسید هیدروژن را در گروه دارو های کم ضرر ( با اولویت نظارت کم   LPR ) رده بندی کرده است.

آزمایش:

در اینجا ما برای رنگ آمیزی اسپور ها از روش  schaeffer – falton استفاده می کنیم. در رنگ آمیزی wirty Conklin  تمامی مراحل مانند رنگ آمیزی schaeffer – falton است با این تفاوت که هنگامی که رنگ مالاشیت گرین را اضافه کردیم حرارت نمی دهیم و در رنگ آمیزی DORNER   نیز از نکروزین استفاده می کنیم. بعد از انجام آزمایش خواهیم دید اسپور باکتری ها در کدام قسمت قرار گرفته است ، داخل ( Center , terminal , sub terminal  ) یا خارج باکتری.

ابزار و مواد مورد نیاز آزمایش:

مالاشیت گرین ، سافرانین ، آنس حلقوی ، لام ، گیره ، سینی رنگ آمیزی ، پلیت حاوی باکتری

شرح آزمایش:

در اول باید یک گسترش ( Smear ) تهیه کنیم. آنس حلقوب را با حرارت ضد عفونی می کنیم و با آن یک قطره آب روی لام می گذاریم. از پیپت باکتری ، در کنار شعله با آنس حلقوی ، مقداری باکتری بر می داریم و در قطره آب روی لام پخش می کنیم. پس از خشک شدن آن را روی شعله می گیریم تا ثابت شود.

حال محلول مالاشیت گرین را روی لام میرزیم و به مدت۳ تا ۵ دقیقه حرارت می دهیم اما این حرارت نباید به طوری باشد که سبب تبخیر مالاشیت گرین شود. پس از این لام را با آب شستشو می دهیم و محلول سافرانین را روی لام میریزیم. پس از گذشت یک دقیقه آن را با آب  شستشو می دهیم زیر نور لامپ قرار می دهیم تا خشک شود.

بعد از خشک شدن لام می توانیم آن را با میکروسکوپ بررسی کنیم. مقداری روغن ایمرسون یا سدر به آن اضافه می کنیم و با عدسی ۱۰۰ می توانیم مشاهده کنیم.

در مشاهده خواهیم دید که اسپورها سبز رنگ ( به رنگ مالاشیت گرین) و سلول های رویشی باکتری قرمز رنگ ( به رنگ سافرانین ) هستند. اسپورها را در دو حالی بیرونی ( External ) و داخلی ((  Internal  مشاهده می شود.

انواع محیط کشت میکروبی و اصول تهیه آنها

میکروارگانیسم ها همانند سایر موجودات زنده برای ادامه زندگی به محیط زیست نیاز دارند که مواد لازم جهت متابولیسم و تکثیر آنها را دارا باشد.ضمنا این محیط باید دارای دما,فشار اسمزی و PH  مناسب نیز در حدود ۲/۷ باشد.میکروارگانیسم ها علاوه بر محیط های زیست طبیعی خود توانایی زندگی در محیط های ساخته شده را نیز دارند که آنها را محیط کشت مصنوعی می نامند.

انواع محیط کشت

محیط های کشتی که در میکروب شناسی به کار برده می شوند انواع مختلف دارند و آنها را می توان از جنبه های گوناگون از جمله حالت و از نظر متمایز سازی تقسیم بندی کرد.

انواع محیط کشت از نظر حالت

۱-محیط کشت جامد (Solid ):

این محیط کشت دارای پسوند آگار می باشد چرا که به نسبت ۲ تا ۳ درصد حاوی آگار بوده و همین میزان آگار می تواند باعث جامد شدن یک محیط کشت جامد گردد.آگار تجارتی ماده خشک است شبیه سلولز که اگر در آب سرد ریخته شود باد می کند و اگر بجوشد کاملا حل می شود در عین حال در کمتر از ۴۵ ذرجه سانتی گراد به حالت جامد درمی آید.آگار به حد کافی مواد غذایی ندارد و باید آن را با مواد غذایی دیگر مخلوط کرده و مورد استفاده قرار داد نوترین آگار مثالی از یک محیط کشت جامد است.

محیط کشت نیمه جامد (semisolid):

این نوع محیط کشت به وسیله اضافه کردن ۱ تا ۵/۱ درصد آگار به محیط کشت مایع کشت دارای پسوند مدیوم (medium) می باشد مثل SIM  (sulfide-Indol-Motility )مدیوم که از آن می توان برای بررسی حرکت باکتری ها استفاده کرد.

محیط کشت مایع : (Fluid ) :

این نوع محیط کشت دارای پسوند براث (Broth) است و حالت جامد یا ژله ای ندارد از این نوع محیط می توان نوترین براث را نام برد.

انواع محیط کشت از نظر متمایز سازی:

محیط های کشت مختلف برای تشخیص و جداسازی باکتری ها به کار می روند بر چهار نوع اند:

۱-محیط های کشت عمومی(ساده):

این محیط ها دارای کلیه مواد لازم جهت رشد باکتری ها هستند و به علت نداشتن مواد ضد میکروبی تقریبا تمام باکتری ها می توانند در آن رشد کنند.محیط کشت نوترین آگار از این نوع محیط کشت است.

۲-محیط های کشت غنی شده:

این محیط ها به واسطه اضافه کردن خون یا سرم به محیط های کشت ساده فراهم می شوند.این محیط ها می توانند رشد یک سری باکتری های پر نیاز را فراهم کنند مثل محیط بلاد آگار یا سرم لفلر که مورد اخیر جهت کشت باسیل دیفتری به کار می رود.

۳-محیط های کشت افتراقی:

این محیط ها به علت داشتن یک سری مواد ویژه و در عین حال ضد میکروبی باعث تمایز برخی از باکتری ها می شوند مانند محیط  ائوزین متیلن بلو(E.M.B ) و مک کانکی که حاوی لاکتوز و معرف های شیمیایی هستند و به همین علت باعث تمایز باکتری هایی می شوند که لاکتوز را تخمیر می کنند.همچنین محیط هایی  مثل سلینت F و تتراتیونات براث وجود دارند که رشد باکتری سالمونلا را در نمونه مدفوع افزایش داده و از رشد دیگر باکتری ها جلوگیری می نمایند.

۴-محیط های کشت اختصاصی (انتخابی):

این محیط ها فقط برای رشد باکتری های ویژه ای مناسبند مثلا در محیط کشت مانیتول سالت آگار (Manitol Salt Agar )که دارای قند مانیتول و مقدار زیادی نمک ۵/۷ درصد است فقط باکتری هایی قادر به رشد هستند که اولا مانیتول را تخمیر کنند ثانیا در مقابل غلظت زیاد نمک طعام مقاوم باشند مانند باکتری استافیلوکوک بیماری زا که تین توانایی را داراست.

اصول تهیه محیط کشت:

امروزه اکثر محیط های کشت مورد استفاده در میکروب شناسی به صورت پودرهای آماده وجود دارند که برای تهیه آنها باید طبق دستور مقدار معینی از هر محیط کشت را با مقدار مناسبی آب مقطر مخلوط کرد برای این منظور ابتدا مقدار لازم را در ارلن مایر می ریزیم و مقدار پودر مشخص شده را به تدریج در آن وارد می کنیم و هم می زنیم تا پودر گلوله نشود و به طور یکنواخت حل گردد.گاهی برای تهیه محیط های کشت لازم است مقادیر معینی از مواد مختلف را با مقدار مناسبی آب مقطر مخلوط کرد.در هر صورت در مواقعی که آگار در ترکیب محیط کشت وجود دارد باید آن را در محیط حل کرد به این منظور بعد از مخلوط کردن مقدار لازم پودر و آب ضروری است که مخلوط حاصل به حدود یک دقیقه جوشانده شود تا رنگ محیط کاملا شفاف گردد به این منظور می توان از بن ماری و یا شعله مستقبم باید محیط را مرتب به هم زد تا آگار ته نگیرد و نسوزد پس از آماده شدن محیط باید آن را توسط اتوکلاو سترون کرد.در مورد برخی از محیط های اختصاصی مثلا سالمونلا –شیگلا-آگار سترون کردن محیطط لازم نیست. اگر منظور تهیه محیط کشت در پلیت باشد محیط را در همان ارلن مایری که تهیه کرده ایم در داخل اتوکلاو به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه استریل می کنیم پس از بیرون آوردن ارلن حاوی محیط کشت از داخل اتوکلاو اجازه می دهیم تا دمای آن حدود بین ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتی گراد کاهش یلبد سپس در کنار شعله با رعایت شرایط سترون به مقدار ۱۰ تا ۱۵ سی سی در هر پلیت تقسیم می کنیم و سپس سطح محیط داخل هر پلیت را به منظور از بین بردن حبابهای احتمالی هوا توسط شعله تیز شعله دهی می کنیم.

برای تهیه محیط کشت در لوله آزمایش باید پس از مخلوط کردن و حرارت دادن مقدار پودر و آب مقطر مشخص در داخل ارلن محیط مذکور را در داخل لوله های آزمایش تقسیم نمود . معمولا تا ۱/۳ لوله ها را از محیط کشت پر می نمایند و سپس آنها را اتوکلاو می کنند.اگر منظور تهیه محیط آگار شیب دار باشد باید لوله ها را بعد از خارج کردن اتوکلاو به طور کج قرار داد تا محیط کشت بسته شود . برای تهیه محیط آگار تال (agartall ) مثل SIM لوله را به طور عمودی قرار می دهند تا محیط ببندد . در هر حال در تمام موارد باید دهانه لوله ها یا ارلن ها را قبل از اتوکلاو کردن خوب مسدود کرد و پنبه را به نحوی در دهانه لوله ها گذاشت که مقداری  از آن در داخل لوله و مقداری هم در بیرون قرار بگیرد به طوری که به راحتی بتوان آن را برداشت .(در هر صورت نباید آنقدر شل باشد که به آسانی بیفتد.) در نهایت محیط های پلیتی و لوله ای را به مدت ۲۴ ساعت قرار دادن در انکوباتور به منظور چک کردن آلوده بودن یا نبودن آنها به طور وارونه قرار می دهند . محیط ها را تا هنگام مصرف باید به طور وارونه در یخچال نگه داشت تا از تبخیر آب آنها جلوگیری شود.این محیط های کشت در صورت نگه داری در یخچال تا یک هفته قابل استفاده اند

روش تهیه محیط خون دار

برای تهیه محیط های خون دار از خون (دفیبرینه) خرگوش-گوسفند و … استفاده می شود ولی ترجیحا خون انسان نباشد .

۱-ابتدا مقدار لازم از محیط پایه بلاد را بر اساس دستورالعمل روی قوطی آن با مقدار لازم از آب مقطر مخلوط و اجازه دهید تا حدود ۱ دقیقه بجوشد

۲-این محیط را سترون سازید

۳- ۵تا ۱۰ درصد از خون مورد نظر را به محیط پایه بلاد بیفزایید.دمای محیط پایه در حدود ۴۵ تا ۵۰ درجه سانتی گراد باشد به طوری که دست را نسوزاند و آن قدر هم سرد نباشد که محیط ببندد

۴-مخلوط را تکان دهید تا کاملا حل شود

۵-محیط را در پلیت ها تقسیم کنید (با رعایت شرایط سترون سازی در مجاورت شعله)

از این محیط برای کشت باکتری هایی مثل استرپتوکوک و پنوموکوک که درانسان بیماری زا هستند استفاده می شود.

روش تهیه محیط ائوزین متیلن بلو (E.M.B )

۱-مقدار لازم از پودر ائوزین متیلن بلو را وزن کنید

۲-مخلوط را در ۱۰۰۰ سی سی آب کاملا حل کنید

۳-مایع به دست آمده را و سترون سازید

۴-محیط سترون شده را در پلیت ها تقسیم کنید . این محیط باید در طی یک هفته مورد استفاده قرار گیرد بر خلاف سایر محیط ها نمی توان آن را در ظروف و یا شیشه های کتابی بیش از یک هفته نگه داشت و پس از ذوب مجدد از آن استفاه کرد.این محیط دارای لاکتوز و معرف شیمیایی ائوزین متیلن بلو (جهت جلوگیری از رشد باکتری های گرم مثبت) است.به همین جهت باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر می کنند در این محیط به رنگ قرمز تا سیاه ظاهر می شوند و باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر نمی کنند کلنی هایی بی رنگ یا به رنگ محیط به وجود می آورند مثلا اشریشیا کلی در این محیط کلنی سیاه رنگ تولید می کند و روی پلیت سایه ای از رنگ سبز متالیک (جلای سبز رنگ)دیده می شود.

روش تهیه محیط S.I.M

۱-      مقدار لازم پودر مورد نظر را (طبق نوشته روی ظرف محتوی پودر )وزن کنید

۲-      پودر حاصل را در ۱۰۰۰ سی سی آب کاملا حل کنید

۳-      مایع حاصل را در لوله های آزمایش تقسیم کنید

۴-      دهانه لوله ها را به وسیله پنبه مسدود کنید

۵-      لوله ها را توسط اتوکلاو سترون کنید

۶-      لوله ها را پس از سترون کردن به طور عمودی قرار دهید تا محیط که نیمه جامد است بسته شود از این محیط جهت بررسی حرکت باکتری ها و قدرت تجزیه و آزاد سازی گوگرد توسط باکتری مورد نظر استفاده می شود

روش تهیه محیط نوترین آگار (N.A. ):

۱-مقداری گرم از پودر آماده را در ۱۰۰۰ سی سی آب حل کنید. (بر اساس دستورالعمل روی قوطی کشت)

۲-مایع حاصل را چند دقیقه بجوشانید تا رنگ محیط کاملا شفاف شود (برای این کار از حمام ماری ی شعله مستقیم استفاده کنید.در صورت استفاده از شعله مستقیم باید محیط را مرتب هم زد تا آگار ته نگیرد و نسوزد)

۳-محیط های تهیه شده را به وسیله اتوکلاو سترون کنید

۴-محیط تهیه شده را در پلیت ها تقسیم کنید

 از این محیط برای کشت اکثر باکتری ها استفاده می شود

محیط های پنج گانه (گالری افتراقی)

این محیط ها که در غالب موارد با هم استفاده می شوند در داخل لوله آزمایش تهیه می گردند و معمولا جهت شناسایی باکتری های خانواده انتروباکتریاسه از هم به کار می روند و شامل Triple Suger Iron Agar (T.S.I) , Sulfide Indo Motility Medium (S.I.M ) , SimmonCitar Agar (S.C ) , Urea Broth (U ) , Methyle Red VogesProskauer Broth (MR.VP   می باشد.

از این محیط دارای مشخصات خاصی هستند به طوری که محیط TSI قرمز رنگ و دارای سه قند گلوکز ,لاکتوز و سوکروز می باشد که به صورت دو قسمت عمقی (Butt ) و شیب دار (Slant ) تهیه می شود و جهت تشخیص قابلیت باکتری ها در استفاده از لین سه قند و تخمیر آنها (همراه با ایجاد گاز CO2 و یا بدون تولید آن ) و از طرفی تولید گاز H2S به کار می رود..تخمیر قندها به واسطه تولید اسید و زرد رنگ شدن محیط TSI مشخص می شود به طوری که اگر باکتری فقط قادر به تخمیر گلوکز باشد فقط قسمت عمقی و هم قسمت شیب دار زرد رنگ می شود.از طرفی تولید گاز CO2 به واسطه ایجاد حباب یا ترک خوردگی در محیط کشت یا بالا فرستادن محیط کشت مشخص می شود.محیط سیمون سیترات (S.C ) نیز محیطی است سبز رنگ و شیب دار که حاوی سیترات می باشد که اگر باکتری دارای آنزیم سیتراتازیا سیترات لیاز باشد با مصرف و تبدیل آن به کربنات سدیم رنگ محیط را از سبز به آبی تغییر می دهد.محیط SIM محیطی است نیمه جامد و زرد کم رنگ که به واسطه آن سه آزمایش تولیدH2S تولید اندول و حرکت باکتری ها مورد بررسی قرار می گیرد. این محیط فقط دارای عمق است و به صورت Stab کشت داده می شود.

تولید اندول به وسیله اضافه کردن چند قطره معرف کوآکس برسطح محیط SIM و تغییر رنگ معرف به صورتی تا بنفش نمایان می شود.حرکت باکتری نیز که در تشخیص انواع باکتری از آن استفاده می شود به واسطه وجود کدورت در اطراف محل ورود آنس در این محیط پس از ۲۴ ساعت مشخص می گردد.بررسی تولید H2S در محیط SIM آهن پپتونه است که مناسب تر از معرف سولفات آهن موجود در TSI است.محیط MR.VP نیز محیطی است مایع و به رنگ زرد کم رنگ که جهت دو تست متیل ردو ووگس پروسکوئر به کار می رود .برای تشخیص باکتری های تولید کننده ۳ و ۲ بوتانیدول ,آزمایش (VP ) به کار میرود ولیکن اساس آزمایش تشخیص ماده پیش ساز ۳ و ۲ بوتانیدول یعنی استوئین (استیل متیل کربینول) می باشد که طی واکنش هایی از گلوکز موجود در محیط (MR.VP ) حاصل می شود.

برای تشخیص باکتری های تولید کننده مخلوطی از اسیدها نظیر اسید لاکتیک ,اسید سوکسینیک و اسید فرمیک که از گلوکز موجود در محیط MR.VP حاصل می شوند آزمایش متیل رد MR.VP را که در زمان انکوباسیون آن طی شده در دو لوله تقسیم نمایید.به لوله اول معرف متیل رد MR) ) به میزان ۵/۰ سی سی اضافه کنید .تغییر رنگ محیط به قرمز نشان دهنده وجود اسید در نتیجه تخمیر قند گلوکز است .جهت انجام آزمایش VP نیز به لوله دوم ۶/۰ سی سی آلفانفتول و ۲/۰ سی سی پتاس ۴۰ درصد اضافه کنید.در صورت وجود استوئین رنگ محیط به صورتی مایل به قرمز تغییر رنگ پیدا می کند.محیط اوره نیز محیطی است به رنگ به رنگ نارنجی روشن پوست پیازی که به صورت مایع است و به منظور شناسایی باکتری هایی به کار می رود که دارای آنزیم اوره آز هستند که به واسطه این آنزیم می توانند اوره موجود در محیط کشت را به آمونیاک (NH3 ) تبدیل نمایند. در این صورت رنگ محیط کشت به واسطه قلیایی شدن محیط به رنگ صورتی تا قرمز در می آید.

رنگ آمیزی کپسول باکتری

مقدمه

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی رامی پوشانداین لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی داردو همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

کاربرد کپسول در باکتریها :

کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع  نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.

در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.

در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.

در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.

رنگ آمیزی کپسول : هدف از انجام این رنگ آمیزی، رنگ کردن کپسول باکتریایی است، بدین منظور برای مشاهده کپسول باکتریایی و رنگ آمیزی آن از یک باکتری دارای کپسول و یک باکتری فاقدکپسول استفاده می شود. کلبسیلانمونیا یک باکتری غیرمتحرک و کپسول دار با طول ۶-۶/٠ میکرومتر و به صورتهای تکی، جفتی و یا زنجیره های کوتاه مشاهده می شود. سلولهای این باکتری ها حاوی تمایز زیادی کپسول پلی ساکاریدی هستند و همین امر سبب ایجاد کلونی های موکوئیدی بزرگ از این باکتری ها می شود. بیش از ٨٠ آنتی ژن کپسولی در کلبسیلا یافت نشده است که در تعیین نوع مروتایپهای آن بسیار مفید است. کلبسیلا در ضایعات انسانی، نمونه های کلینیکی، آب، حبوبات وغلات، میوه ها و همچنین سبزیجات یافت می شوند. باکتری آلکالی ژنس دنتری نیکانس که توانائی احیای و را دارد . بسیاری از باکتریها مثل باسیلوس آنتراسیس «عامل سیاه زخم»، استرپتوکوکوس موتانس «عامل پوسیدگی دندان»، استرپتوکوکوس نمونیا «عامل ذات الریه» و قارچ کریپتوکوکوس نئوفرمانس «عامل کریپتوکوکوزیس» بوسیله یک لایه ژلاتینی محاصره و پوشیده شده اند که این لایه کپسول نامیده می شود. در آزمایشگاه های تشخیص طبی نشاندن وجود و حضور کپسول به منظور شناساسیی و تشخیص میکروارگانیسم بیماری زا و همچنین تعیین میزان و شدت بیماری حاصله از آن صورت می گیرد . برخی خصوصیات ساختاری کپسول مثل ضخامت کپسول در بین سویه های یک گونه باکتریایی کاملاً متفاوت است. ترکیباتی مانند پلی ساکاریدها، پلی پپتیدها و گلیکوپروتئین ها در ساختار تمام کپسول ها یافت می شوند. در اکثر موارد یک باکتری بیماری زا با ضخامت کپسول زیاد «کپسول ضخیم» نسبت به همان نوع باکتری فاقدکپسول و یا کپسول نازکتر از قدرت تهاجمی و بیماری زائی بیشتری برخوردار است، بنابراین کپسول از باکتری در برابر فعالیتهای فاگوسیتوزی سلولهای فاگوسیت بدن میزبان حفاظت می کند. حضور کپسول در اکثر اوقات بوسیله روشهای رنگ آمیزی از قبیل رنگ آمیزی منفی و جوهر هندی مشخص می گردد. ناحیه بی رنگ اطراف سلول باکتری احتمالاً مربوط به جدا شدن سلول از رنگ های احاطه کننده اطراف سلول در حین مرحله خشک کردن است. در روش برای شناسایی وجود و حضور کپسول ها عبارتند از : ١. روش رنگ آمیزی آنتونی «آنتونی جی آر باکتری شناس دانشگاه تگزاس در ایالت آستین در سالهای ١٩٣٠ بوده است» . ٢. روش رنگ آمیزی گراهام و ایوان در روش آنتونی از دو رنگ استفاده می شود، یکی رنگ اولیه و ابتدائی که کریستال ویولت است که محتویات باکتری و کپسولش صورتی تیره می شوند. برخلاف سلول کپسول غیریونی است و بنابراین رنگ به خود نمی گیرد. در این روش از سولفات مس به عنوان عامل رنگ برنده استفاده می شود. این ترکیب اضافه رنگ اولیه را از کپسول خارج می کند. در همین زمان سولفات مس بعنوان یک رنگ زمینه ای عمل می کند و به درون کپسول وارد شده و آن را به رنگ آبی کم رنگ یا صورتی در می آورد. در این فرآیند نمونه نبایستی بوسیله حرارت تثبیت شود زیرا این انقباض به صورت خودبخودی رخ می دهد ویک ناحیه شفاف را در اطراف باکتری بوجود می آورد که به اشتباه به جای کپسول در نظر گرفته می شود . رنگ آمیزی به روش آنتونی : در گوشه سمت چپ لام نام باکتری مورد نظر را که برای رنگ آمیزی آنتونی قرار است به کار ببریم می نویسیم. یک لوپ کامل از محیط کشت را برداشته و بروی اسلاید و لام قرار می دهیم و اجازه می دهیم که در دمای اتاق کاملاً خشک شود. لام را بروی راک رنگ آمیزی قرار داده و به مدت ٧-۴ دقیقه با کریستال ویولت رنگ آمیزی کرده، سپس بعد از رنگ آمیزی با سولفات مس لام را شستشو می دهیم. در مرحله بعد با کاغذ صافی لام را خشک می کنیم. در این مرحله با افزودن روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم که کپسول یک هاله را در اطراف سلول تیره باکتری تشکیل داده است . روش تغییریافته رنگ آمیزی کپسول ( روش گراهام و ایوانس ) : با استفاده از الکل و پارچه تمیز لامی را که قرار است مورد استفاده قرار گیرد تمیز می کنیم. به میزان دو لوپ از محیط کشت را با مقدار ٢-١ قطره از جوهر هندی در یک انتهای لام با هم مخلوط می کنیم، سپس این ترکیب مخلوط به آرامی و آهستگی به سمت دیگر لام پخش و گسترده می نماییم تا یک لایه نازک تشکیل شود. نمونه را خشک می کنیم، بهتر است در هوای اتاق خشک شود. با استفاده از آب مقطر لام را شستشو داده اما باید مراقب بود که باکتریها روی لام پاک نشوند. به مدت یک دقیقه به آن کریستال ویولت اضاف می نماییم. دوباره با آب شستشو می دهیم ، سپس برای مدت زمان سی ثانیه با سافرانین رنگ آمیزی می کنیم. دوباره با آب شستشو داده و آنرا خشک می کنیم. چنان چه کپسول وجود داشته باشد باکتریهای صورتی تا قرمزرنگ در یک هاله شفاف قرار دارند و رنگ زمینه هم تیره و سیاه می شود .

روش کار در رنگ آمیزی کپسول :

۱- روی یک لام تمیز بمقدار مساوی از مرکب چینی و سرم فیزیولوژی را با هم مخلوط کرده و با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری را به آن اضافه کنید ، سوسپانسیون را به آرامی و کاملا مخلوط کنید و گسترش را پخش کنید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود.

۱-  سطح گسترش را با آبی متیلن لوفلر بپوشانید و بگذارید ۳ دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و بعد با آب مقطر آنرا شستشو دهید. در این هنگام ممکن است مقداری از گسترش نیز شسته شود و این جای نگرانی ندارد چون گسترش ضخیم است و حتما مقداری از آن برای مطالعه شما باقی می ماند.

۲-  لام را با زاویه ۴۵ درجه نگدارید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود . توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ خشک کن را روی آن نکشید.

اگر محیط مایع بود استفاده از سرم فیزیولوژی ضروری نیست .

هنگام مخلوط کردن کشت با مایع به آرامی هم بزنید تا آرایش باکتریها بهم نخورد.

طرز تهیه رنگها و محلولها :

۱- آبی متیلن لوفلر

- آبی متیلن                           ۳/.گرم

- اتانول۹۵%                        ۳۰سی سی

- آب مقطر                           ۱۰۰سی سی

رنگ را در اتانول حل کنید . آب مقطر را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را با استفاده از قیف از کاغذ صافی عبور دهید.

۲- سرم فیزیولوژی

- کلرور سدیم                       ۸۵/.گرم

- آب مقطر                         ۱۰۰سی سی

کلرور سدیم را در آب مقطر حل کنید.

گزارش کار تیتراسیون فتومتری

دستور کار آزمایشگاه تجزیه دستگاهی

 پاورپوینت گزارش کارهای تجزیه دستگاهی

1. اندازه‌‌گيري آهن به روش اسپكتروفتومتری

2. اندازه‌گيري فسفات به روش اسپكتروفتومتری

3. تعيين ka شناساگرهاي اسيد و باز

4. تعيين نسبت تركيب و ثابت تشكيل كمپلكس‌ها به روش نسبت مولی

5. اندازه‌گيری همزمان كروم و منگنز ياKMnO4, K2Cr2O7 به روش اسپكتروفتومتری

6. تيتراسيون‌هاي اسپكتروفتومتری

7. اسپكتروسكوپی نشر شعله (Flame photometry)

8. اندازه‌‌گيری مس به روش اسپكتروسکوپی جذب اتمی

9. اندازه‌‌گيری مس به روش اسپكتروسکوپی جذب اتمی

10. جداسازی کاتيونهای Fe3+  وCo2+ توسط کروماتوگرافی مبادلۀ يون

11. ظرفيت و ثابت مبادله يون در رزين دي وينيل بنزن پلی استايرن بفرم كاتيونی RSO3-H+

برای خرید با شماره یا ایمیل زیر تماس حاصل فرمایید 

  mail : m.aryan55@yahoo.com                   tell : 09357795285

میکروب شناسی خاک

مقدمه:

مواد زاید ناشی از انسان و جانوران و همچنین اندام های مختلف جانداران اعم از گیاه و جانور مستقیما وارد خاک شده و سبب حاصلخیزی آن می شوند .خاکهای حاصلخیز یکی از مراکز تجمع میکروارگانیسم ها هستند.انواع گوناگونی از باکتری ها ,قارچ ها ,جلبک ها ,ویروس ها ,پروتوزوئرها در خاک زندگ می کنند.تعداد تقریبی میکروارگانیسم های خاک با میزان مواد آلی موجود در آن ارتباط دارد.شمارش تعداد باکتری های خاک توسط میکروسکوپ تعداد تقریبی آنها را بیش از چند میلیون در هر گرم خاک نشان می دهد ولی چنانچه این شمارش در روی محیط کشت انجام شود تعداد آنها در حدود چند میلیون در هر گرم خاک محاسبه می شود.علت چنین اختلافی این است که نمی توان محیط کاملا مساعدی از نظر فیزیکی و شیمیایی تهیه کرد که کلیه ی باکتری های خاک قادر به رشد در آن باشند.به عنوان مثال میکروبهای بی هوازی در سطح سطح محیط های عادی در شرایط هوازی رشد نمی کنند یا آنکه باکتری های بی هوازی تثبیت کننده ی ازت و اکثر باکتری های تجزیه کننده ی سلولز در محیط آگار غذایی رشد نم کنند و همچنین باکتری های احیا کننده ی سولفاتها برای رشد به وجود سولفاتها و ماده ی آلی اکسید کننده نیاز دارند.

به طور کلی عوامل موثر بر جمعیت و نوع میکروارگانیسم های موجود در خاک عبارتند از:

۱-مقدار و نوع مواد غذایی

۲- دما

۳- اثر میکروارگانیسم ها بر یکدیگر

۴- رطوبت

۵- PH

6- عوامل بیرونی مثل سیل و انسان

۷- میزان هوای موجود در خاک

۸- وجود ریشه گیاهان در خاک

نقش میکروارگانیسم ها در تجزیه ی مواد آلی و تبدیل آن ها به مواد کانی قابل استفاده برای گیاهان عامل مهمی است که زندگی بدون آن امکان پذیر نیست.تغییراتی که میکروارگانیسم ها در مواد ایجاد می کنند باعث گردش عناصر در جهان زنده می شود.

روش انجام آزمایش:

۱-در ۹ لوله آزمایش ۹ سی سی آب ریخته شود سپس ۱ گرم از نمونه خاک را لوله اول وارد کرده آن را خوب مخلوط کنید سپس ۱ سی سی از مخلوط را  از لوله اول با پیپت سترون برداشته در لوله دوم بریزید.دقت کنید پیپت نباید داخل آب شود و از قسمت  بالای لوله پیپت را خالی کنید و سپس با یک پیپت دیگر از لوله دوم برداشته در لوله سوم بریزید و خوب به هم بزنید.پیپت را کنار گذاشته با پیپت های دیگر این عمل را تا لوله هفتم ادامه دهید.

۲- از هر یک از ۴ رقت آخر ۱ سی سی در پلیت های سترون بریزید و رقت آن را پشت پلیت بنویسید.

۳-از آگار ذوب شده که گرمای آن حدود ۴۵ درجه سانتی گراد است به هر پلیت ۱۰ سی سی اضافه کنید و با حرکات دورانی در جهت حرکت عقربه های ساعت و خلاف آن محیط را با این ۱ سی سی رقت مورد نظر خوب مخلوط کنید.

۴- بعد از سفت شدن محیط پلیت ها آنه را ۴۸ ساعت در دمای ۲۸ درجه سانتی گراد قرار دهید و پس از این مدت پلیتی را که بین ۱۰ تا ۳۰۰کلنی دارد از بین رقتها انتخاب کنید و کلنی های آن را بشمارید و در ضریب رقت ضرب کنید .مثلا اگر پلیت چهارم حاوی ۲۰ کلنی باشد تعداد تقریبی باکتری های موجود در یک گرم خاک برابر است با:

۲۰ ×۱۰۰۰۰ =